Imagen longitudinal intravital de la dinámica vascular en la médula ósea del calvario

Esta investigación se centra en comprender la dinámica vascular en el macroambiente de la médula ósea utilizando microscopía intravital, con el objetivo de revelar cómo responden los vasos sanguíneos a la hematopoyesis normal y patológica. Utilizamos tecnologías avanzadas de imágenes como la fotomicroscopía, modelos animales transgénicos y analizamos un marcador para visualizar y cuantificar los cambios vasculares dinámicos en el tejido vivo a lo largo del tiempo. El avance clave es un refinamiento de nuestro protocolo para mejorar el bienestar animal y alinearse con las tres R. Nuestro enfoque longitudinal minimiza los pasos quirúrgicos y reduce significativamente la cantidad de animales necesarios para nuestro estudio.

Nuestro protocolo aborda la necesidad de imágenes intravitales no tóxicas a largo plazo mediante el uso de un microscopio de dos fotones, que permite la penetración profunda en el tejido y la visualización de alta resolución del comportamiento y la interacción celular. El uso del implante de cabeza impreso en 3D hará que sea muy fácil encontrar el área de interés durante la sesión de imágenes longitudinales sin tener que cambiar la altura, el ángulo o el orden. Actualmente estamos utilizando este protocolo para rastrear subtipos endoteliales específicos y su respuesta al desarrollo de la leucemia y al tratamiento farmacológico para comprender mejor su contribución a la patogénesis de la enfermedad.

Para comenzar, inicie el software de segmentación e importe los archivos DICOM de micro-CT para aislar el cráneo. Realice una segmentación basada en umbrales para separar el tejido óseo de las estructuras circundantes. Ajuste manualmente las regiones complejas o ruidosas para refinar la segmentación.

En 3D Slicer, importe los archivos DICOM y cargue el conjunto de datos. Observe los cortes de TC en las vistas de corte axial, sagital y coronal. Abra el editor de segmentos y haga clic en Agregar para crear una nueva segmentación, luego haga clic en Agregar nuevamente para crear un nuevo segmento para el umbral.

En el panel del editor de segmentos, haga clic en el efecto de umbral. Ajuste los controles deslizantes de umbral inferior y superior o introduzca valores numéricos para resaltar la región segmentada en rojo. Para exportar el cráneo segmentado como un archivo stl, cambie al módulo de segmentación.

Asegúrese de que el segmento con umbral esté seleccionado. En la sección exportar/importar modelos y mapas de etiquetas, establezca el tipo de exportación en modelos y el formato de archivo en stl, luego haga clic en exportar para guardar el archivo. Para la preparación del modelo de cráneo en CAD, primero importe el modelo de cráneo simplificado en formato stl al software CAD como una nueva pieza o modelo.

En el plano medio, cree un eje tangencial a la calvaria, luego guarde el modelo de cráneo preparado. Crea un boceto en el plano calvarial y diseña una spline en forma de pera desde AP más 6,5 hasta menos dos. Con un ancho de seis milímetros en AP 0.0, este será el contorno de la superficie observable.

Diseñe la cola del implante asegurándose de que se ajuste a la estructura del cráneo para una fijación adecuada respetando el volumen disponible. Finalmente, cree una cubierta protectora para proteger la ventana de observación cuando no esté en uso. Coloque un ratón anestesiado en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados y controle visualmente la frecuencia respiratoria.

Afeitar la cabeza del ratón con una maquinilla de afeitar eléctrica. Luego aplique una gota de gel oftálmico en los ojos del ratón. Asegúrese de eliminar todo el vello para evitar artefactos de imagen y reducir el riesgo de infección de la herida.

Ahora, use un par de fórceps estériles y tijeras para hacer una pequeña incisión en la parte central del cuero cabelludo para exponer la cicatriz ósea central. Retire el tejido conectivo entre el cráneo y el cuero cabelludo. Mezcle suficiente cemento dental en una placa de Petri para hacer una pasta.

Aplíquelo rápidamente en la parte inferior del implante de fijación de la cabeza. Sin permitir que el cemento dental entre en el área de imágenes, coloque el soporte para la cabeza sobre el cráneo expuesto y déjelo reposar. Encienda el flujo de isoflurano hacia la máscara estereotáxica del microscopio.

Ahora, lleve el ratón rápidamente al microscopio. Inserte con cuidado los dientes del ratón en la máscara para asegurar una penetración adecuada del isoflurano levantando la nariz con una mano. Mientras sostiene el mouse con una mano, deslice suavemente la cola de milano del implante de fijación de la cabeza en el soporte de fijación con la otra mano.

Asegúrelo con media vuelta de la perilla de tornillo. A continuación, introduzca una sonda rectal preincrustada con un gel a base de agua para controlar la temperatura del ratón. Llene la cámara de imágenes del cabezal con una gran cantidad de gel a base de agua o PBS.

Baje el objetivo de inmersión en agua hasta que esté completamente sumergido para una excitación óptima y detección de señales durante la excitación de dos fotones. Mueva la etapa x, y y la unidad z para enfocarse en el hueso central de la cicatriz del andamio. Identificar el tejido marcado por la superficie ósea y la vena central.

Apague la luz de la habitación y cierre la caja alrededor del soporte del microscopio. Después de activar los detectores que no son TOSCAN. Configure PMT1 para detectar un segundo SHG de 423 a 461 nanómetros, D2 alto para GFP de 485 a 548 nanómetros y D3 alto para TD D'Amato de 551 a 645 nanómetros.

Deje el desplazamiento en cero. Ahora, establezca la ganancia PMT SHG en 850 voltios y las altas ganancias D al 100% Aumente la potencia del láser infrarrojo hasta que una imagen con un rango dinámico de 200 niveles de gris sea visible en el más bajo de los tres canales. En el software de adquisición, la región localizadora que contiene bolsas de médula ósea, indicadas encerradas dentro de las superficies óseas.

Para identificar diferentes regiones de interés, o ROI, active Loss Navigator y cree una descripción general utilizando el modo espiral. Haga clic en el icono de una sola imagen para registrar las posiciones de ROI seleccionadas y cambiar el nombre de cada posición en la lista de tareas. Para adquirir un volumen de pila Z, seleccione el modo de pila Z y defina el tamaño del paso en tres micrómetros.

Anule la selección de la opción de tamaño de pila para todas las regiones y, a continuación, pulse Comenzar para empezar y Fin para terminar. Después de capturar, haga clic en redefinir pila. Presione iniciar para iniciar la recopilación de imágenes y guardar las imágenes en la carpeta correspondiente.

Para medir una característica dinámica, como la permeabilidad vascular, cambie el modo de adquisición a XYZT para adquirir un lapso de tiempo. En el módulo T, ajuste el intervalo de tiempo a tres minutos y la duración a una hora. Ahora, inyecte 100 microlitros de 70 kilodalton Dextran TRITC por vía intravenosa a una concentración de cuatro miligramos por mililitro, y comience la adquisición.

Después de transferir el ratón a una marca de cirugía en una almohadilla térmica a 37 grados Celsius, aplique gel intrasitio en el cráneo para mantenerlo hidratado. Cierre el área de imágenes del implante de cabeza con la cubierta específica y asegure cuidadosamente la cubierta con un tornillo. Coloque el mouse en la caja de calentamiento a 37 grados centígrados y espere a que se despierte.

Una vez que el ratón se haya recuperado por completo, transpórtelo a la instalación del animal y alójelo en una jaula limpia con hidrogel y enriquecimiento ambiental. Para adquisiciones longitudinales, coloque una pequeña gota de gel oftálmico en los ojos de un ratón con un soporte para la cabeza ya instalado. Obtenga la imagen de información general como se ha demostrado anteriormente.

Si es necesario, vuelva a alinear las imágenes anteriores y nuevas utilizando el módulo de carga y alineación de imágenes. Abra la imagen de captura de pantalla para marcar las posiciones en su lugar original. El modelo CAD de un implante de fijación de la cabeza de titanio fue diseñado para ajustarse a la estructura anatómica del cráneo, asegurando una fijación estable a la platina del microscopio para imágenes a nivel celular.

El implante se adhirió con éxito al cráneo del ratón y permitió imágenes estables a lo largo del tiempo, al tiempo que permitió que el ratón mantuviera sus actividades normales. La vasculatura de la médula ósea calvarial se visualizó mediante un escaneo de mosaico, revelando una compleja red de arteriolas, capilares de transición y sinusoides. El análisis cuantitativo de vasos demostró la segmentación de las estructuras vasculares, lo que permitió medir el diámetro, la longitud y la rectitud de los vasos, y su correlación.

Las imágenes longitudinales capturaron la remodelación progresiva de la vasculatura calvarial durante la progresión de la leucemia con un aumento de la densidad vascular observado con el tiempo. La permeabilidad vascular se evaluó dinámicamente, mostrando retención diferencial de colorante fluorescente a lo largo del tiempo, mostrando permeabilidad diferencial de diferentes vasos de la médula ósea.