Estudio multimodal de la remodelación cardiovascular murina: ecografía cuatridimensional y espectrometría de masas

Nuestro laboratorio utiliza imágenes de ultrasonido preclínico para estudiar la biomecánica cardiovascular en diversas enfermedades y estados fisiológicos. También utilizamos imágenes de espectrometría de masas para estudiar la distribución espacial de los lípidos en el tejido cardiovascular y cerebral. Estamos tratando de ver en qué parte del tejido tenemos cambios funcionales y moleculares.

Aunque las técnicas comunes de diagnóstico por imágenes moleculares, como la histología y la inmunohistoquímica, pueden proporcionar datos moleculares, están limitadas por las tinciones y los anticuerpos disponibles en la actualidad. Por otro lado, las imágenes de espectrometría de masas son un enfoque no dirigido para estudios multiómicos que aún mantiene la integridad espacial del tejido. Con nuestra técnica, podemos ampliar la multiómica para incluir lípidos, glicanos y péptidos, y acoplarlos con técnicas de imagen funcionales, como el ultrasonido.

Con estas técnicas, los investigadores ahora pueden acoplar imágenes funcionales con técnicas de imagen molecular. En nuestro laboratorio, tenemos dos áreas de enfoque principales para las enfermedades cardiovasculares, y una de ellas es observar la remodelación cardíaca con ataques cardíacos o tratamientos contra el cáncer, es decir, la cardiotoxicidad. Y nuestro segundo gran objetivo cardiovascular es analizar el envejecimiento y cómo el envejecimiento afecta a la vasculatura.

Para realizar una ecografía cardíaca en cuatro dimensiones, coloque el ratón en posición supina sobre la placa de imagen. A continuación, coloque el transductor en el soporte en una posición semibloqueada. Alinee el punto elevado del transductor con el punto azul de la pantalla, colocándolo hacia el lado derecho del ratón.

Gire el transductor para alinearlo a lo largo del plano sagital del ratón con la muesca elevada apuntando hacia caudal. Aplique una cantidad generosa de gel de ultrasonido en la superficie ventral de la cavidad torácica para el acoplamiento acústico con un transductor. Baje el transductor hasta que entre en contacto con el gel de ultrasonido.

Realice ajustes precisos con las perillas XY en la base de la placa para un ajuste fino. A continuación, asegúrese de que la vista periesternal del eje largo en la pantalla incluya el ápice, el tracto de salida del ventrículo izquierdo y la aorta, alineados horizontalmente para obtener imágenes precisas. Seleccione Nombre de imagen en la esquina inferior de la pantalla para guardar la imagen en la serie actual.

Gire el transductor 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para obtener una vista periesternal del eje corto. Asegúrese de que el ventrículo izquierdo esté claramente definido en la imagen y que los músculos papilares sean visibles. Selecciona el icono del cubo en la esquina superior izquierda de la pantalla para configurar una imagen en cuatro dimensiones.

Después de reiniciar el transductor, ajuste la posición de inicio justo debajo del ápice y la posición de parada al arco aórtico. Establezca el tamaño del paso en 0,08 a 0,13 milímetros y la velocidad de fotogramas en 200 a 300 hercios. Asegúrese de que los signos vitales y la señal del electrocardiograma permanezcan estables antes de iniciar la exploración.

Después de completar el escaneo y el procesamiento, active Guardar datos EKV/4D y Respiration Gating para el posprocesamiento. Seleccione Nombre de imagen en la esquina inferior derecha e incluya el ID del mouse en el nombre. Para visualizar cada plano de visión a lo largo del ciclo cardíaco, seleccione Más controles y, a continuación, elija Cargar en cuatro dimensiones.

Revise cada vista plana del corazón, confirmando que el centro del corazón permanece estable durante todo el ciclo cardíaco. Para comenzar, prepare botes de papel de aluminio para la congelación instantánea de tejidos de ratón. Con pinzas, coloque la piel del ratón sacrificado y corte la piel con unas tijeras sobre el cuello para el acceso vascular o justo debajo del esternón para el acceso cardíaco.

Continúa cortando a través de la piel y las capas musculares para exponer la vasculatura. Para la extracción del corazón, corte a través del hueso para exponer el corazón. Usando una disección roma con hisopos de algodón, aísle el corazón o la vasculatura de los tejidos circundantes, incluida la grasa.

Separe cuidadosamente el vaso carotídeo del nervio. Luego, extirpa el corazón o la vasculatura con instrumentos quirúrgicos. Coloque el vaso carotídeo, el corazón y la vasculatura en un bote de papel de aluminio preetiquetado.

Luego, coloque los botes en nitrógeno líquido para que se congelen rápidamente. Para empezar, llene un vaso de precipitados con agua de HPLC y déjelo a un lado junto con jeringas de cinco y un mililitro. Luego, ajuste la temperatura del criostato a menos 25 grados centígrados e inserte la cuchilla.

Coloque un par de pinzas dentro de la cámara del criostato para que se enfríen antes de montar el tejido. Extraiga cinco mililitros de agua de HPLC en una jeringa y colóquela en el criostato para congelar parcialmente el agua. Antes de que el agua de la jeringa se congele por completo, explíquela en el mandril de metal y deje que se congele por completo.

Ahora, llene una jeringa de un mililitro con agua HPLC y colóquela en el criostato. Después de 30 a 60 segundos, coloque una pequeña cantidad de agua parcialmente solidificada en el centro del mandril. Con pinzas, coloque rápidamente el corazón de ratón extraído en la gota de agua y manténgalo allí hasta que el agua circundante esté completamente congelada.

Para comenzar, retire la corredera con el corazón del mouse montado del congelador y colóquela en un desecador para que se seque. Encienda el HTX M3+Sprayer. Abra la aplicación HTX en la computadora portátil y, en el Método, configure la temperatura de la boquilla a 75 grados Celsius, el caudal a 100 microlitros por minuto y la presión a 10 psi.

Registre el nombre de la muestra, la polaridad, la matriz, el disolvente y la concentración en el cuaderno de laboratorio. A continuación, calcule la cantidad de matriz necesaria para la concentración deseada. A continuación, pese la cantidad deseada de ácido 2,5-dihidroxibenzoico para la matriz de modo positivo.

Disuelva la matriz en metanol al 70% en un tubo de 15 mililitros. Sonicar la solución matricial durante 10 minutos. Durante la sonicación, retire la corredera del desecador.

Abra la bandeja del rociador. Luego, coloca la diapositiva en la esquina inferior izquierda y pega los bordes con cinta adhesiva. Seleccione la región de pulverización de la muestra y cierre la bandeja.

Con una jeringa y un filtro, extraiga la solución de matriz en la jeringa. Filtre la solución de matriz a través de la jeringa en el vial con la tapa negra ubicada en el lado izquierdo del rociador. Vuelva a colocar el vial en su lugar designado en el rociador e inserte el tubo de la línea D de forma segura en el vial.

A continuación, encienda el gas inerte y confirme que el manómetro del pulverizador marque 10 psi. Presione Inicio y, una vez que el rociador alcance la temperatura establecida, seleccione el botón de inicio parpadeante para comenzar a rociar. Una vez finalizada la pulverización, retire la muestra del pulverizador y colóquela en el soporte de portaobjetos MALDI.

Escanee el soporte de portaobjetos MALDI y diapositiva con un escáner. Guarde la imagen en una unidad flash para usarla con imágenes de espectrometría de masas. Seleccione la opción Lavar en el pulverizador y mueva la línea D del vial de matriz al vaso de precipitados de residuos.

Finalmente, rocíe metanol en la bandeja del rociador y límpiela. Apague el nitrógeno. Las imágenes de espectrometría de masas MALDI de tejido miocárdico infartado identificaron una masa de iones moleculares para cargar 577.52, probablemente correspondiente a COHb en C o D, lo que sugiere participación en la remodelación miocárdica.

La ecografía cuatridimensional mostró regiones miocárdicas con una magnitud de deformación de menos del 20% de la superficie, visualizadas como tejido verde-amarillo, lo que indica zonas infartadas. En la vista de eje largo del tejido del infarto de miocardio, la deslocalización lipídica fue visible, lo que complicó la correlación entre la biomecánica del tejido y la composición molecular.