Análisis de citometría de flujo de la expresión de factores tisulares en plaquetas humanas

En este protocolo, proponemos un tutorial paso a paso para medir el factor tisular asociado a las plaquetas mediante citometría de flujo sanguíneo total, evaluando la proteína en el compartimento intracelular, en condiciones de detención y en la superficie celular, tanto en estado de reposo como en activación Con una DP, uno de los factores tisulares agonistas plaquetarios más comunes se expresa mediante un subconjunto de plaquetas. Si las plaquetas con factor tisular positivo se miden en plasma rico en plaquetas PRP o en plaquetas lavadas, este subconjunto puede perderse durante la preparación de la muestra. Este riesgo no se produce cuando esta evaluación se realiza en la pared.

El factor tisular asociado a la placa sanguínea ha sido controvertido desde el primer informe publicado a principios de siglo debido a cuestiones preanalíticas y metodológicas. Este protocolo arroja luz sobre estas cuestiones y también está siendo utilizado para llevar a cabo un proyecto internacional apoyado por la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia ISDH para estandarizar la medición del factor tisular asociado a las plaquetas o citometría de flujo sanguíneo que se realiza en unos pocos microlitros de sangre, lo que permite un análisis del factor tisular asociado a las plaquetas adecuado en el ámbito clínico. Además, la posibilidad de fijar la muestra y etiquetarla posteriormente, hacen que este análisis sea factible para muchos hospitales y laboratorios.

Para comenzar, prepare un tubo de ensayo para cada volumen de anticuerpos. Para realizar la prueba, agregue una gota de perlas negativas y una gota de perlas positivas a cada tubo de ensayo. Agregue 20 microlitros de cada dilución de anticuerpos al tubo de ensayo y al vórtice.

Incubar inmediatamente los tubos de ensayo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego agregue un mililitro de PBS sin calcio y magnesio pH 7.4 a cada tubo y vórtice, invierta suavemente el vacutainer de citrato de sodio cinco veces para mezclar bien la sangre y el anticoagulante. Transfiere 50 microlitros de sangre a un tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, añada 950 microlitros de aldehído paraformado al 1%. Mezcle e incube suavemente la muestra durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugar la muestra a 1.500 g durante cinco minutos con una pausa a temperatura ambiente.

Después de eliminar el sobrenadante Reese, suspenda el pellet en un mililitro de PBS sin calcio ni magnesio. A pH 7,4, dispense 100 microlitros de sangre fija en cada tubo y centrifugue a 1.500 g durante cinco minutos. Con pausa a temperatura ambiente, luego retire el sobrenadante resus.

Suspender el pellet en 100 microlitros de 0,1%Triton PBS para perme las muestras e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para comenzar, prepare un tubo para la fluorescencia menos un control y un tubo para la tinción con factor tisular. Añadir anticuerpos a 100 microlitros de sangre entera fija y permanente en cada tubo.

Añadir 300 microlitros de PBS sin calcio y magnesio a pH 7,4 a cada tubo y mezclar. A continuación, almacene las muestras teñidas en la oscuridad hasta que el análisis de citometría de flujo diluya alfa CD 1 42 HTF un anticuerpo monoclonal, y Alexa Fluer 6 33 cabra anti inmunoglobulina G de ratón en PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, prepare tres tubos de muestra y dispense PBS sin calcio ni magnesio.

A pH 7,4, dispense 7,5 microlitros de alfa CD 1 42 htf diluido un anticuerpo monoclonal y agregue cinco microlitros de difosfato de adenosina. Invierta suavemente el citrato vacutainer cinco veces para mezclar bien la sangre y el anticoagulante. Dispense cinco microlitros de sangre entera en cada tubo.

Mezcle suavemente las muestras e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para la fijación de la muestra, añadir 300 microlitros de PFA al 1% a cada tubo y centrifugar a 1.500 g durante cinco minutos con pausa a temperatura ambiente. Una vez retirado el sobrenadante, resus suspender el pellet en 90 microlitros de PBS sin calcio ni magnesio.

A pH 7,4, mediante pipeteo suave, dispense cinco microlitros de inmunoglobulina G diluida Alexa Fluer 6 33 y cinco microlitros de alfa CD 41 PE en cada tubo. Incubar las muestras durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, añada 300 microlitros de PBS sin calcio y magnesio a un pH de 7,4 a cada tubo y mezcle.

Para comenzar, cree un diagrama de puntos de área de dispersión frontal y área de dispersión lateral en una escala logarítmica que muestre todos los eventos, cree un diagrama de puntos de área de dispersión lateral y CD 61 A en una escala logarítmica que muestre todos los eventos. Para visualizar la población de plaquetas, establezca el umbral en aproximadamente 2000 en la altura de dispersión lateral y 1000 en el por CP B six 90 H.Ajuste el PE Y 5 8 5 y por CP B six 90 ganancia de acuerdo con el control de calidad diario y ajuste el caudal a bajo. Ahora dibuja una región entre 10 rayos a la potencia de tres y 10 rayos a la potencia de cinco llamada CD 61 positivo.

Para identificar la población de plaquetas, duplique el FMO y cámbiele el nombre a TFIC. Adquiera las muestras y grabe un archivo de datos de 10.000 eventos dentro de la puerta positiva CD 61. Cree un diagrama de puntos de área de dispersión hacia adelante y área de dispersión lateral en una escala logarítmica que muestre todos los eventos.

Cree un diagrama de puntos de CD 41 A y área de dispersión lateral en una escala logarítmica que muestre todos los eventos. A continuación, ajuste la ganancia de Alexa floor 6 33 y la ganancia de PE wifi 5 8 5 según el control de calidad diario. Establezca el umbral aproximadamente en 1000 en la altura de dispersión lateral y en 2, 500 en PEY 5 85 H.To visualizar la población de plaquetas, establezca el caudal en bajo.

Ahora dibuje una región entre 10 radios a la potencia de cuatro y 10 elevada a la potencia de cinco llamada CD 41 positivo para identificar la población de plaquetas. A continuación, crea un tubo para cada muestra y nombra TF Unstimulated y TF Stimulated. Adquiera las muestras y registre un archivo de datos de 10.000 eventos dentro de la centrífuga de marcha positiva CD 41.

El vacutainer de citrato de sodio 0,129 molar a 100 G durante 10 minutos sin descanso a temperatura ambiente. A continuación, retire el vacutainer de la centrífuga. Recoja el plasma rico en plaquetas obtenido, transfiéralo a un tubo de polipropileno de 10 mililitros y registre el volumen recolectado, cuente las plaquetas dos veces en el plasma rico en plaquetas utilizando un contador de células sanguíneas.

La población de plaquetas identificada por tinción de anticuerpos alfa CD 61 mostró que aproximadamente el 26,8% de las plaquetas circulantes contenían factor tisular intracelular. El análisis de citometría de flujo indicó que el factor tisular se expresa en aproximadamente el 2,8% de las plaquetas en reposo y aumenta hasta el 24,5% al activarse con difosfato de adenosina. Se demostró que las plaquetas de mayor tamaño expresan niveles más altos de factor tisular, y los puntos verdes representan el subconjunto de plaquetas más grande. El análisis de citometría de flujo demostró que el plasma rico en plaquetas preparado mediante centrifugación de 100 g preservó una población similar a la sangre total, reteniendo plaquetas de mayor tamaño con mayor positividad del factor tisular.

Una mayor fuerza de centrifugación condujo a una pérdida de plaquetas positivas para el factor tisular más grande, como lo indica la reducción de la dispersión hacia adelante en la población de PRP.