Name: Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda a inducir interferencia de ARN en larvas de Bombyx mori mediante nanopartículas de quitosano/dsRNA administradas por vía oral. Este método eficiente permite estudios de regulación génica y cribado de genes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Alimentación con dsRNA mediada por nanopartículas para el silenciamiento génico en larvas de gusanos de seda

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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+function+of+bombyx+toll9-2+in+the+silkworm+%28Bombyx+mori%29+larval+midgut%3A+Activation+by+escherichia+coli%2Flipopolysaccharide+and+regulation+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Insect+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth.</a> Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).</li>
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<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+interference+in+Lepidoptera%3A+An+overview+of+successful+and+unsuccessful+studies+and+implications+for+experimental+design%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).</li>
<li>Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+nanocarriers+mediated+dsrna+delivery+in+gene+silencing+for+Helicoverpa+armigera+biocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol.</a> Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>para la reacción de dsRNA o nanopartículas</td></tr><tr><td>10 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>para aspirar o resuspender líquido</td></tr><tr><td>100 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>para aspirar o resuspender líquido</td></tr><tr><td>2.5 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>para aspirar o resuspender líquido</td></tr><tr><td>20 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>para aspirar o resuspender líquido</td></tr><tr><td>200 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>para aspirar o resuspender líquido</td></tr><tr><td>Placas de pocillos múltiples transparentes con tratamiento TC transparente de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>para la cría individual de gusanos de seda</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Aladdin</td><td>A116165</td><td>para fabricar TAE</td></tr><tr><td>Agarose M</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610013</td><td>para electrofosis en gel de agarosa</td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>para pesar los ingredientes</td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>para centrífugar para formar dsRNA o nanopartículas</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>para combinar con dsRNA para la preparación de nanopartículas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>para hacer TAE</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Aladdin</td><td>E130059</td><td>para hacer TAE, o para la precipitación de dsRNA</td></tr><tr><td></td><td>Congelador Siemens</td><td>iQ300</td><td>para almacenar dsRNA o nanopartículas</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>para reacción de PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>para reacción qRT-PCR</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>para la precipitación de dsRNA</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>ThermoFisher</td><td>One</td><td>para determinar la concentración de dsRNA</td></tr><tr><td>medidor de ph</td><td>Sartorius</td><td>&nbsp; PB-10</td><td>para preparar tampones</td></tr><tr><td>Columna SanPrep Kit de purificación de productos PCR</td><td>Sangon</td><td>B518141</td><td>para la purificación de productos PCR</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>para hacer 100 mM tampón de acetato de sodio</td></tr><tr><td>Sulfato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>para fabricar 100 mM de tampón de sulfato de sodio</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>para la síntesis de dsRNA</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>para la generación de dsRNA o el calentamiento de nanopartículas</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A501492</td><td>para hacer TAE</td></tr><tr><td>Vortex&nbsp;</td><td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>para preparar nanopartículas de quitosano/dsRNA</td></tr></tbody></table>

interferencia de arn larvario en el gusano de seda bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsrna

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

Para evaluar la eficiencia del ARNi, se eligió un gen inmune dirigido a BmToll9-2 para el análisis. El gen BmToll9-2 está bien caracterizado en el laboratorio, y el silenciamiento del gen mediante la inyección de dsRNA da como resultado larvas más ligeras y pequeñas en nuestra reciente publicación20. Para confirmar la eficacia del ARNi por ingestión a través de nanopartículas de quitosano/dsRNA, se utilizaron nanopartículas de quitosano como control y se comparó el dsRNA desnudo al mismo tiempo.
En comparación con el control, las nanopartículas de quitosano sin dsRNA, el dsRNA desnudo dirigido al gen BmToll9-2 no muestra ningún efecto silenciador. La alimentación de nanopartículas de quitosano/dsRNA en el gusano de seda inhibe significativamente la transcripción, con un knockdown del 79% (Figura 1). La inhibición de la transcripción relativa indica que el gen BmToll9-2 fue silenciado con éxito a través de la ingestión de quitosano/dsRNA.
La eliminación del gen BmToll9-2 afecta significativamente el crecimiento del gusano de seda. Al observar las larvas, las larvas silenciadas por BmToll9-2 son más pequeñas que las larvas de control (Figura 2A). Al comparar los capullos, los capullos silenciados por BmToll9-2 también son más pequeños (Figura 2B). Las nanopartículas de quitosano/dsRNA muestran efectos exitosos de ARNi tanto en la transcripción como en el fenotipo en el gusano de seda.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg"> Figura 1: Transcripción relativa de BmToll9-2 después de la ingestión de nanopartículas de quitosano/dsBmToll9-2 en larvas de B. mori en el5º estadio. Los niveles relativos de ARNm de BmToll9-2 en las larvas alimentadas con nanopartículas de quitosano como control, dsRNA desnudo y nanopartículas de quitosano/dsRNA. Los datos se representaron como medias ± desviación estándar de tres repeticiones biológicas. Para cada replicación biológica, hubo tres réplicas técnicas. Las diferentes letras en las barras indican diferencias significativas basadas en el análisis de ANOVA de un factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg"> Figura 2: Observación del fenotipo después de la alimentación con nanopartículas de quitosano/dsBmToll9-2. Las nanopartículas de quitosano se utilizan como control. (A) La aparición de larvas de gusano de seda después de la ingestión de nanopartículas. (B) La aparición de capullos de gusanos de seda después de la ingestión de nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

larval-rna-interference-silkworm-bombyx-mori-through-chitosandsrna

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ARN de interferencia (RNAi) basados ​​en técnicas de genes desmontables son el núcleo de la investigación Tribolium. Aquí, ofrecemos una visión general de nuestra técnica de RNAi larval en Tribolium castaneum. Larval RNAi es una técnica sencilla, pero de gran alcance que proporciona un acceso rápido a los fenotipos de pérdida de función, lo que permite a los investigadores estudiar las funciones de genes en diversos contextos.

La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina, Tribolium castaneum

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

Este manuscrito muestra el agotamiento de la expresión génica en el midgut de la cucaracha alemana a través de la ingestión oral de ARN bicatenario encapsulado en liposomas.

Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.

Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN

Aquí, presentamos un método detallado de remojo de interferencia de ARN en Bursaphelenchus xylophilus para facilitar el estudio de las funciones de los genes.

Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus

La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .

Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

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Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

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Interferencia de ARN larvario en el gusano de seda Bombyx mori a través de la entrega de nanopartículas de quitosano/dsRNA

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