Name: Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a medir la actividad enzimática de DUBs asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante ensayos de escisión de cadenas de ubiquitina in vitro. Este método permite evaluar el impacto de variantes genéticas en la función celular.

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El siguiente protocolo se puede adaptar para proteínas recombinantes utilizando varias etiquetas de afinidad expresadas en diferentes cepas de células competentes. Dependiendo de la proteína que se exprese, las condiciones de cultivo y expresión nocturna pueden requerir la optimización de la OD600 en la inducción de la expresión, el tiempo de expresión, la temperatura de expresión y la concentración de IPTG. En la Figura 1 se ilustra una descripción general del protocolo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Transformación de células competentes de Rosetta 2 E. coli con el plásmido de expresión recombinante GST-USP27X
NOTA: Para mantener la esterilidad del cultivo bacteriano, realice pasos en los que los recipientes de medios estén abiertos bajo una llama de mechero Bunsen. Para permitir una transferencia óptima de oxígeno, realice la agitación del cultivo bacteriano en un agitador de temperatura controlada de sobremesa con una órbita de 19 mm a 50 mm y una velocidad de 200 rpm29.
<ol>
	<li>Descongele 20 μL de células de Rosetta 2 E. coli químicamente competentes en hielo inmediatamente antes de usar. Añadir 1-10 ng del plásmido de expresión pGEX6P1-USP27X (que codifica para la glutatión-S-transferasa N-terminal (GST)30 -marcado con USP27X y que contiene resistencia a la ampicilina) e incubar 5 min en hielo.</li>
	<li>Choque térmico durante 30 s a 42 °C en baño seco. Incubar en hielo durante 2 min.</li>
	<li>Agregue 80 μL de medio SOC a temperatura ambiente (RT). Incubar durante 60 min a 37 °C con rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm con control de temperatura.</li>
	<li>Placa de 50 μL de cultivo en una placa de agar LB suplementada con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C con la tapa hacia abajo en una incubadora con temperatura controlada.</li>
</ol>
2. Expresión bacteriana nocturna de proteína recombinante a partir de plásmido de expresión
NOTAS: Para mantener la esterilidad del cultivo bacteriano, realice pasos donde los recipientes de medios estén abiertos bajo una llama de quemador Bunsen. Para permitir una transferencia óptima de oxígeno, realice la agitación del cultivo bacteriano en un agitador de temperatura controlada de sobremesa con una órbita de 19 mm a 50 mm y una velocidad de 200 rpm29. Mida el diámetro exterior del cultivo600 con un espectrofotómetro.
<ol>
	<li>Prepare 1 L de medio Terrific Broth (TB) añadiendo 47,6 g de TB Powder a 1 L de agua ultrapura con 0,4% de glicerol en un matraz de cultivo con deflector de 2 L. Medio de autoclave durante 30 min y enfriamiento a RT.</li>
	<li>Elija una sola colonia de bacterias transformadas y agregue 10 mL de medio LB estéril suplementado con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C con rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm con control de temperatura.</li>
	<li>Añadir 10 mL de cultivo durante la noche a 1 L de medio TB suplementado con 25 μg/L de cloranfenicol y 50 μg/L de ampicilina (proporción 1:100 entre el cultivo inicial y el cultivo de expresión). Incubar a 37 °C con una rotación de 200 rpm en un agitador de sobremesa de 19 mm de órbita con control de temperatura hasta que el diámetro exterior decultivo 600 esté entre 0,5 y 0,6.</li>
	<li>Añadir 50 μM de IPTG al cultivo para inducir la expresión, enfriar a 16 °C e incubar durante 20 h a 16 °C con una rotación de 200 rpm.</li>
	<li>Células granuladas de cultivo de expresión por centrifugación durante 20 min a ≥3.000 x g y 4 °C. Almacene el pellet a -80 °C durante al menos 1 h. NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde (preferiblemente la misma semana). El pellet se puede almacenar a largo plazo a -80 °C.</li>
</ol>
3. Purificación de proteínas por columna de afinidad de flujo por gravedad
NOTA: La resina, el aglutinante, el lavado, la elución y los tampones de almacenamiento apropiados para cada purificación dependerán de la proteína recombinante que se purifique. Recoja muestras de las fracciones de pellets de celda, sobrenadante, flujo, lavado y elución en tampón SDS-PAGE. Realice la tinción SDS-PAGE y Coomassie de las muestras para evaluar el éxito de la purificación. Realizar la purificación a 4 °C y manipular fracciones en hielo. La escisión de las etiquetas de proteínas se puede realizar dentro o fuera de la columna utilizando la proteasa adecuada para dirigirse al sitio de escisión específico de la proteasa relevante.
<ol>
	<li>Asegure la columna de flujo por gravedad vacía en el soporte de retorta y llénela con resina de glutatión agarosa. Utilice 2-3 mL de resina para purificar un pellet celular recogido de 1 L de cultivo de expresión.</li>
	<li>Lave la columna con un volumen de lecho de resina de etanol al 20%. Lave la columna 3 veces con un volumen de lecho de resina de tampón MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Detenga la columna para que la resina permanezca cubierta con tampón para evitar que se seque mientras prepara el pellet de celda.</li>
	<li>Descongele el pellet de celda a 4 °C. Añada 30 mL de tampón MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lisozima y un comprimido de inhibidor de la proteasa) al pellet descongelado. Lisar durante 30 min a 4 °C con una rotación suave de extremo a extremo.</li>
	<li>Sonicar células lisadas en un tubo de centrífuga de 50 ml o en un vaso de precipitados metálico sobre hielo hasta que el lisado fluya libremente cuando se dispense desde la punta de una pipeta. Centrifugar durante 30 min a 4 °C y ≥20.000 x g para eliminar el sobrenadante. NOTA: Determine empíricamente los ajustes del sonicador. Configure el sonicador de manera que 120 s de tiempo total sean suficientes para reducir el lisado viscoso a un líquido transparente y de flujo libre.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados y cargar el lisado aclarado en la columna. Pase el lisado a través de la columna por flujo por gravedad mientras recoge el flujo a través. Cargue la columna con el flujo recopilado y pásela por la columna.</li>
	<li>Lave la columna con al menos dos volúmenes de lecho de resina de tampón de lavado MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 veces. Recoja el flujo de lavado en fracciones de 5 mL. Añada 1 μL de cada fracción a 100 μL de reactivo Bradford para comprobar visualmente la presencia de proteínas. Lavar hasta que la proteína no unida ya no esté presente en el último lavado, agregando pasos de lavado adicionales si es necesario.</li>
	<li>Recupere la proteína haciendo pasar el tampón de elución MS500 (tampón MS500 suplementado con 10 mM de glutatión y 10 mM de NaOH) a través de la columna, recogiendo fracciones de elución de 5 mL. Compruebe la presencia de proteínas añadiendo 1 μL de eluido a 100 μL de reactivo Bradford. Deje de recolectar fracciones cuando el reactivo de Bradford ya no indique que hay proteínas presentes.</li>
	<li>Realizar el intercambio de tampones por precipitación y centrifugación. Precipitar la proteína añadiendo 2 volúmenes de 4 M de sulfato de amonio al eluido, invirtiendo suavemente hasta que esté turbio, y luego centrifugando durante 30 min a 4 °C y ≥20.000 x g y de nuevo durante otros 5 min. Retire el sobrenadante después de cada centrifugación sin alterar la pastilla de proteína.</li>
	<li>Vuelva a disolver y almacenar proteínas en MS500 suplementado con 25% de glicerol. Almacene los gránulos de proteína o la proteína en un tampón de almacenamiento a -80 °C.</li>
</ol>
4. Ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro
NOTA: Seleccione la longitud de la cadena de ubiquitina y los tipos de enlace en función de la especificidad de DUB descrita en informes anteriores31 o determinada empíricamente. Si fuera necesario, este protocolo podría utilizarse para probar la actividad del DUB de tipo salvaje de interés en un panel de cadenas de ubiquitina disponibles comercialmente de longitud y tipo de enlace definidos. Se puede utilizar una cantidad de cadena de diubiquitina de 375-750 ng y una concentración de DUB de 1-2 μM como puntos de partida para el ensayo27.
<ol>
	<li>Prepare 10 tampones de activación DUB (500 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl y 100 mM de TCEP).</li>
	<li>Para cada punto de tiempo para cada DUB, prepare 10 μL en total de 2 μM de GST-USP27X purificado en 1x tampón de activación DUB (mezcla DUB). Prepara mezclas maestras y divídelas en puntos de tiempo.</li>
	<li>Incuba la mezcla DUB durante 10 minutos en RT.</li>
	<li>Añada 7 μL de tampón de carga SDS-PAGE al tiempo 0 antes de añadir las cadenas de ubiquitina para evitar que se inicie la reacción de deubiquitilación.</li>
	<li>A cada punto de tiempo para cada DUB, agregue 375 ng de cadenas de di-ubiquitina K-63 diluidas en 10 μL 1x tampón de activación DUB. El volumen total es de 20 μL por reacción.</li>
	<li>Incubar los tubos a 30 °C, deteniéndose en cada punto de tiempo con 7 μL de tampón de carga SDS-PAGE.</li>
	<li>Realice SDS-PAGE con un gel de gradiente de 4%-12% e inmunoblot 7,32 para ubiquitina y USP27X para analizar el cambio en la presencia de mono-ubiquitina en puntos de tiempo seleccionados.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Esquema del diseño del estudio. (A) Transformación de células competentes de E. coli con plásmido de expresión de proteínas recombinantes. (B) Expresión bacteriana durante la noche de la proteína deubiquitilasa recombinante. (C) Purificación de proteínas de desubiquitilasa recombinante utilizando una columna de afinidad de flujo por gravedad. (D) Ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro para evaluar la actividad desubiquitilante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de las variantes de DUB en los trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
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<li>Pickart, C. M., Rose, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase+acts+on+ubiquitin+carboxyl-terminal+amides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides.</a> J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).</li>
<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ubiquitin+C-terminal+hydrolases+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+%28UCH-1%29+with+isopeptidase+activity+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle.</a> J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).</li>
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<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm &times; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitina (monoclonal de ratón)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Policlonal de oveja)</td><td>MRC-PPU Reactivos y servicios</td><td>Cat# S902A Tercera purga</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Deflector Frascos de cultivo</td> 2 <td>L Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reactivo</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Completo, Tabletas Inhibidoras de la Proteasa</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Columna 1.5 &times; 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 pocillos</td><td>gel Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-b-D-Tiogalactopiranósido)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Burro anti-Cabra Anticuerpo Secundario IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Burro anti-ratón Anticuerpo secundario IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td>(<td>WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp Baño seco digital</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Agitador orbital de sobremesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Tampón de funcionamiento</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotador de tubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Tampón de muestras 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odisea&nbsp; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 humano USP27X</td><td>MRC-PPU Reactivos y servicios</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 humano USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 humano USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td></td><td>225716 Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbato 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Células Competentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall RC 6 Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Clorhidrato de tris-(carboxietil) fosfina)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de caldo fantástico</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell y XCell II Blot Module&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Para determinar el impacto de las variantes asociadas a la XLID105 en la actividad catalítica de USP27X, se purificaron a partir de bacterias las proteínas USP27X de tipo salvaje marcadas con GST y las variantes asociadas a XLID105 F313V, Y381H y S404N USP27X. Estas variantes se encuentran dentro del dominio catalítico USP de USP27X (Figura 2A). Debido a que se informó previamente que USP27X escinde las cadenas de ubiquitinaK63 31, las proteínas USP27X de tipo salvaje y las variantes asociadas a la XLID105 F313V, Y381H y S404N USP27X se incubaron con cadenas de di-ubiquitina unidas a K63 durante 1 h. Estas muestras se separaron mediante SDS-PAGE32, y las proteínas ubiquitina y USP27X se analizaron mediante inmunotransferencia. El USP27X de tipo salvaje induce la escisión de la di-ubiquitina, generando monoubiquitina (Figura 2B y Figura 1 complementaria). Las proteínas variantes F313V, Y381H y S404N USP27X asociadas a XLID105 no escindieron estas cadenas. Debido a que las variantes F313V, Y381H y S404N interrumpen la actividad catalítica de USP27X, la interrupción funcional de USP27X parece ser el principal mecanismo subyacente XLID1057. Anteriormente se habían reportado cuantificaciones adicionales y experimentos complementarios7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Impacto de las variantes de XLID105 en la actividad desubiquitilante de USP27X. (A) Diagrama de la estructura de la proteína USP27X humana, que muestra el número de residuos y la ubicación de las variantes XLID105 evaluadas en el dominio USP (púrpura). (B) Las variantes USP27X y XLID105 de tipo salvaje marcadas con GST (F313V, Y381H y S404N) se incubaron con cadenas de di-ubiquitina K63 durante los tiempos indicados. El análisis de inmunoblot se realizó con anticuerpos anti-GST (USP27X) y ubiquitina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Manchas sin recortar de la Figura 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

El presente estudio proporciona protocolos detallados de ensayo de ubiquitilación in vitro para el análisis de la actividad catalítica de la ubiquitina ligasa E3. Las proteínas recombinantes se expresaron utilizando sistemas procariotas como el cultivo de Escherichia coli.

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.

Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con tecnologías de sonda para predecir y validar la interacción entre pequeñas moléculas de la medicina tradicional china y objetivos proteicos.

Detección de compuestos de la medicina tradicional china para inhibir la actividad de UCHL3 basada en la tecnología de sonda de enzimas de acoplamiento molecular y desubiquitinación

Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Aprende a medir la actividad enzimática de DUBs asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante ensayos de escisión de cadenas de ubiquitina in vitro. Este método permite evaluar el impacto de variantes genéticas en la función celular.

Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro (Video) | JoVE Journal

Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

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