Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

Estamos interesados en definir las bases moleculares de los trastornos del neurodesarrollo asociados a variantes génicas en enzimas del sistema ubiquitina. Utilizamos técnicas de vanguardia para diseccionar las vías de señalización controladas por esas enzimas y para determinar el impacto de las variantes genéticas en la biología de las proteínas. La ventaja de este método es que se trata de una técnica independiente del sustrato que no requiere conocimientos previos de los sustratos que están regulados por un DUB específico.

De esta manera, podemos medir directamente el impacto de la varianza génica asociada a los trastornos del neurodesarrollo en la actividad catalítica de DUB y sugerir posibles mecanismos patogénicos. Debido a que las funciones celulares de la mayoría de los DUB son poco conocidas, nuestro laboratorio se centrará en identificar las vías de señalización que median estas enzimas y cómo las variantes genéticas asociadas con enfermedades genéticas afectan estos procesos. Para comenzar, descongele 20 microlitros de células de Rosetta 2 Escherichia coli químicamente competentes en hielo inmediatamente antes de usar.

Agregue de uno a 10 nanogramos del plásmido de expresión pGEX6P1 USP27X e incube durante cinco minutos en hielo. Calentar las células durante 30 segundos a 42 grados centígrados en un baño seco. A continuación, incubar las células en hielo durante dos minutos.

Agregue 80 microlitros de medio SOC a temperatura ambiente a las celdas. Incube durante 60 minutos a 37 grados centígrados con una rotación de 200 RPM en un agitador de sobremesa de 19 milímetros con temperatura controlada. A continuación, coloque 50 microlitros del cultivo en una placa de agar LB, suplementada con cloranfenicol y ampicilina.

Incubar durante 20 horas a 37 grados centígrados, con la tapa hacia abajo, en una incubadora con temperatura controlada. Elija una sola colonia de bacterias transformadas y agréguela a 10 mililitros de medio LB estéril suplementado con cloranfenicol y ampicilina. Incubar durante 20 horas como se muestra anteriormente.

A continuación, añada 10 mililitros del cultivo nocturno a un litro de medio TB suplementado con cloranfenicol y ampicilina. Incubar hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance de 0,5 a 0,6. A continuación, se añada 50 micromolares de isopropil beta-d-1-tiogalactopiranósido al cultivo para inducir la expresión.

Después de enfriar la muestra a 16 grados centígrados, incubar durante 20 horas a 16 grados centígrados con una rotación de 200 RPM. A continuación, centrifugar las células durante 20 minutos a 3000 g o más a cuatro grados centígrados para granular las células del cultivo de expresión. Finalmente, almacene el pellet a menos 80 grados centígrados durante al menos una hora.

Para comenzar, asegure la columna de flujo de gravedad vacía en un soporte de retorta. Llene la columna con dos o tres mililitros de resina de gluthathione agarosa para purificar una pastilla celular recolectada de un litro de cultivo de expresión. Lave la columna con un volumen de lecho de resina de 20%etanol.

Después de lavar la columna, descongele el pellet de celda a cuatro grados centígrados. Agregue 30 mililitros de tampón MS500 al pellet descongelado e incube con una rotación suave de extremo a extremo. A continuación, sonique las células lisadas en un tubo de centrífuga de 50 mililitros sobre hielo hasta que el lisado fluya libremente cuando se dispense desde la punta de una pipeta.

Centrifugar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y 20.000 g o más para eliminar el sobrenadante. A continuación, decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados y cargar el lisado aclarado en la columna. Pase el lisado a través de la columna por flujo de gravedad mientras recoge el flujo.

A continuación, lave la columna con al menos dos volúmenes de lecho de resina de tampón de lavado MS500 y recoja el flujo de lavado en fracciones de cinco mililitros. A continuación, añada un microlitro de cada fracción a 100 microlitros de reactivo Bradford para comprobar la presencia de proteínas. Recupere la proteína haciendo pasar el tampón de elusión MS500 a través de la columna y recolectando fracciones de elución de cinco mililitros.

Para precipitar la proteína, agregue dos volúmenes de sulfato de amonio de cuatro molares al eluido e invierta suavemente el tubo hasta que se vuelva turbio. Centrifugar durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y 20.000 g o más. Retire el sobrenadante después de cada centrifugación sin alterar la pastilla de proteína.

A continuación, vuelva a disolver la proteína en el tampón MS500 suplementado con un 25% de glicerol antes de almacenarla. Prepare 10 microlitros de USP27X purificado marcado con GST en tampón de activación de enzima desubiquitilante para cada punto de tiempo para cada enzima desubiquitilante. Antes de agregar cadenas de ubiquitina, agregue siete microlitros de tampón de carga SDS-PAGE a la muestra de tiempo cero para evitar que comience la reacción de deubiquitilación.

A cada punto de tiempo para cada enzima desubiquitilante, agregue 375 nanogramos de cadenas de di-ubiquitina unidas a K63 diluidas en 10 microlitros de tampón de activación enzimática. Incubar los tubos a 30 grados centígrados, deteniéndose en cada punto de tiempo añadiendo siete microlitros de tampón de carga SDS-PAGE. Realice SDS-PAGE con un gel de cuatro a 12% de degradado.

El USP27X de tipo salvaje escindió las cadenas de di-ubiquitina unidas a K63 en mono-ubiquitina después de una hora de incubación. La varianza F313V, Y381H y S404N asociada a XLID-105 no rompió las cadenas de di-ubiquitina unidas a K63 después de una hora de incubación.