Name: Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende el ensayo de coinvasión de esferoides de macrófagos y células tumorales en matriz de colágeno 3D. Este método permite estudiar la interacción entre el sistema inmune y el cáncer in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Examen de las interacciones entre macrófagos y esferoides tumorales en una matriz de colágeno en 3D

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &micro;-Angiogénesis de portaobjetos&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Aglutinante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I Cola de Rata&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& Célula</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fiyi&nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 Versión: 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Línea</td> celular Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td>H1299-GFP</td> Albúmina sérica humana Sigma-Aldrich A5843 Leica TCS SP8 X Leica l-glutamina&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS Miltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Pozo, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GEN 2&nbsp;</td><td>Industrias Científicas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

La Figura 1 muestra un esferoide H1299-GFP fotografiado en los respectivos días de incubación en una matriz de colágeno I. Una imagen de campo claro respectiva, tomada en el día 0, también muestra los macrófagos humanos primarios cocultivados con el esferoide. La imagen representativa registrada el día 3 del experimento se amplía después del procesamiento. Se indican diferentes parámetros que se pueden analizar, incluido el número de células invasoras, los sitios de invasión colectiva y el perímetro esferoide. La tabla incluida muestra los resultados obtenidos de esta imagen. El número de señales detectadas coincide con la impresión visual. No se observan alteraciones del esferoide central, lo que indica una invasión real de células cancerosas individuales en lugar de células derivadas de desechos esferoides. Los resultados de diferentes esferoides y condiciones ahora se pueden comparar a través del análisis estadístico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
Figura 1: Resultados representativos. (Panel superior) Imagen del esferoide H1299-GFP en el día 0, día 1, día 2 y día 3 de incubación en una matriz de colágeno I. (Panel central izquierdo) Una imagen de campo claro del esferoide que muestra los macrófagos humanos primarios cocultivados. (Panel central a la derecha) Una imagen representativa adquirida en el día 3 ampliada después del procesamiento, que muestra los diferentes parámetros que se pueden analizar (perímetro del esferoide en rojo; trazado manualmente para una mejor visualización). (Panel inferior) Los resultados obtenidos de la imagen en el panel central derecho. Nota: Los macrófagos no son visibles, ya que solo se registró el canal GFP para dilucidar el comportamiento de las células cancerosas. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Queremos investigar la interacción entre el cáncer y las células inmunitarias para comprender mejor cómo interactúan durante la metástasis. En la mayoría de los casos, los modelos in vivo son la forma rutinaria de llevar a cabo preguntas de investigación sobre la invasión 3D de células cancerosas en el contexto del sistema inmunitario, o se centran en componentes aislados del sistema. Un método que permite el análisis del comportamiento celular que imita la complejidad de la situación in vivo, pero permite una manipulación más directa de características ambientales específicas bajo el microscopio.Demostramos que las células cancerosas inalteradas reducirán la invasión en la matriz de colágeno I 3D cuando se cultivan conjuntamente con macrófagos que se han agotado para la proteína motora KIF16B. Esto apunta a un papel del reciclaje de proteínas de superficie de macrófagos impulsado por KIF16B en el microambiente tumoral. Nos gustaría continuar mejorando nuestro método de una manera que permita la visualización de la degradación de la matriz en la interfaz del contexto de las células cancerosas de macrófagos, obteniendo así una mejor comprensión de los mecanismos degradativos y adhesivos.Para empezar, cultive células H1299 GFP con un medio de células cancerosas en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen el 80% de confluencia. Lave las células una vez con DPBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA durante dos o tres minutos hasta que las células se desprendan. Detenga la reacción enzimática agregando dos mililitros de medios para células cancerosas.A continuación, centrifugar la suspensión de celda separada en un tubo de 15 mililitros a 245 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante que contiene la solución de tripsina antes de lavar el pellet con cinco mililitros de DPBS. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio para células cancerosas.Cuente las celdas usando una cámara de Neubauer. Transfiera 8.000 células a una placa de adhesión ultra baja de 96 pocillos en un volumen final de 25 microlitros de medio para células cancerosas. Incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Después de tres días, revise los esferoides bajo el microscopio para verificar la uniformidad. Después de recolectar la muestra de sangre humana, transfiera 20 mililitros de sangre de una bolsa de transfusión a un tubo de reacción de 50 mililitros. Agregue 15 mililitros de medio de separación de linfocitos en un nuevo tubo de 50 mililitros.Transfiera con cuidado 20 mililitros de sangre al tubo que contiene el medio de separación de linfocitos sin mezclar y centrifugue la mezcla a 450 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Durante la centrifugación, agregue 10 mililitros de RPMI 1640 Medium frío en un nuevo tubo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera la fase blanca densa del tubo que contiene sangre al tubo que contiene RPMI preparado y llénelo hasta 50 mililitros con RPMI frío.Centrifugar la suspensión a 450 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de RPMI frío y llénelo hasta 50 mililitros con RPMI 1640. Vuelva a centrifugar la mezcla y vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de RPMI.Nuevamente, centrifugue la muestra y vuelva a suspender el pellet de celda en 1,5 mililitros de tampón de monocitos frío. A continuación, agregue 250 microlitros de MicroBeads anti CD14 en la suspensión celular e incube durante 15 minutos en hielo. Durante la incubación, prepare una columna de separación conectando un filtro a una rejilla separadora magnética.Agregue 900 microlitros de tampón de monocitos en la columna para equilibrar. Después de la incubación, vierta la suspensión celular en el filtro y deje que fluya por gravedad hacia un tubo de desechos. Agregue un mililitro de tampón de monocitos para lavar la columna que contiene las células unidas a perlas magnéticas.Reemplace el tubo de desagüe debajo de la columna con un tubo nuevo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de RPMI. Agregue tres mililitros de tampón de monocitos a la columna. Retire la columna de la rejilla magnética y coloque el sello.Presione las celdas en el tubo de 50 mililitros preparado y llénelo hasta 30 mililitros con RPMI. Cuente las células utilizando una cámara de recuento de Neubauer bajo un microscopio óptico y ajuste el número de células a dos veces 10 a la potencia de seis células por mililitro con RPMI. Siembre un mililitro de suspensión celular en cada pocillo de una cámara de seis pocillos e incube durante dos a cuatro horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Después de la incubación, verifique si las células se adhirieron correctamente y reemplace el RPMI con 1,5 mililitros de monomedio. Continúe la incubación durante un máximo de seis días hasta que los monocitos se diferencien en macrófagos. Después de derivar macrófagos humanos primarios de las muestras de sangre del donante en una placa de seis pocillos, agregue 500 microlitros de Accutase e incube durante 40 minutos para separar los macrófagos.Luego agregue 500 microlitros de medio y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros para la centrifugación. A continuación, lavar las celdas una vez con dos mililitros de DPBS y contarlas con una cámara de Neubauer. Diluir el número deseado de macrófagos en 40 microlitros de colágeno que mezclo, y agitar brevemente el tubo.Para lavar los esferoides, agregue 300 microlitros de DPBS en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Utilice una punta de pipeta azul de un mililitro con un extremo cortado para recoger el esteroide con DPBS. Una vez que el esteroide se asiente en la punta, empuje brevemente la pipeta hasta el fondo de la cámara de imágenes para transferir el esteroide tumoral por tensión superficial.Elimine la mayor cantidad posible de DPBS residual transferido con el esteroide. Agregue rápidamente 40 microlitros de mezcla de colágeno y macrófagos en la cámara de imagen que contiene esteroides. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en condiciones húmedas para polimerizar completamente la mezcla de colágeno.Después de la polimerización, agregue con cuidado 25 microlitros de medios de células cancerosas a cada pocillo y continúe la incubación durante tres días. Obtenga una imagen de la muestra viva utilizando un microscopio de escaneo láser en los puntos de tiempo deseados. El área del esferoide H1299 GFP se midió en 40.307 micrómetros cuadrados en el tercer día de invasión, mientras que el perímetro del esferoide fue de 1700,17 micrómetros, lo que indica crecimiento a lo largo del tiempo.Se observó una invasión colectiva de células cancerosas desde el esferoide y se identificaron 51 partículas aisladas, que sirvieron como indicador de la invasión de células cancerosas individuales. El esferoide mantuvo una relación de aspecto de 1,10 y una circularidad de 0,18, mostrando una baja deformación.

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Este video muestra un método para establecer un cocultivo tridimensional de esferoide tumoral y células T. Se prepara un molde de agarosa con micropocillos que contienen esferoides tumorales, seguido de la adición de células T. Después de la incubación, esta configuración permite estudiar la interacción de las células T con los esferoides tumorales en un entorno tridimensional controlado.

Un modelo de cocultivo tridimensional de células T infiltrantes en esferoides tumorales

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.

Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

Este artículo representa un ensayo in vitro útil para evaluar la capacidad del medio acondicionado de las células tumorales para atraer macrófagos.

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Aprende el ensayo de coinvasión de esferoides de macrófagos y células tumorales en matriz de colágeno 3D. Este método permite estudiar la interacción entre el sistema inmune y el cáncer in vitro.

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

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