Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Queremos investigar la interacción entre el cáncer y las células inmunitarias para comprender mejor cómo interactúan durante la metástasis. En la mayoría de los casos, los modelos in vivo son la forma rutinaria de llevar a cabo preguntas de investigación sobre la invasión 3D de células cancerosas en el contexto del sistema inmunitario, o se centran en componentes aislados del sistema. Un método que permite el análisis del comportamiento celular que imita la complejidad de la situación in vivo, pero permite una manipulación más directa de características ambientales específicas bajo el microscopio.

Demostramos que las células cancerosas inalteradas reducirán la invasión en la matriz de colágeno I 3D cuando se cultivan conjuntamente con macrófagos que se han agotado para la proteína motora KIF16B. Esto apunta a un papel del reciclaje de proteínas de superficie de macrófagos impulsado por KIF16B en el microambiente tumoral. Nos gustaría continuar mejorando nuestro método de una manera que permita la visualización de la degradación de la matriz en la interfaz del contexto de las células cancerosas de macrófagos, obteniendo así una mejor comprensión de los mecanismos degradativos y adhesivos.

Para empezar, cultive células H1299 GFP con un medio de células cancerosas en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen el 80% de confluencia. Lave las células una vez con DPBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA durante dos o tres minutos hasta que las células se desprendan. Detenga la reacción enzimática agregando dos mililitros de medios para células cancerosas.

A continuación, centrifugar la suspensión de celda separada en un tubo de 15 mililitros a 245 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante que contiene la solución de tripsina antes de lavar el pellet con cinco mililitros de DPBS. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio para células cancerosas.

Cuente las celdas usando una cámara de Neubauer. Transfiera 8.000 células a una placa de adhesión ultra baja de 96 pocillos en un volumen final de 25 microlitros de medio para células cancerosas. Incubar las células durante tres días a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de tres días, revise los esferoides bajo el microscopio para verificar la uniformidad. Después de recolectar la muestra de sangre humana, transfiera 20 mililitros de sangre de una bolsa de transfusión a un tubo de reacción de 50 mililitros. Agregue 15 mililitros de medio de separación de linfocitos en un nuevo tubo de 50 mililitros.

Transfiera con cuidado 20 mililitros de sangre al tubo que contiene el medio de separación de linfocitos sin mezclar y centrifugue la mezcla a 450 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Durante la centrifugación, agregue 10 mililitros de RPMI 1640 Medium frío en un nuevo tubo de 50 mililitros. Después de la centrifugación, transfiera la fase blanca densa del tubo que contiene sangre al tubo que contiene RPMI preparado y llénelo hasta 50 mililitros con RPMI frío.

Centrifugar la suspensión a 450 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de RPMI frío y llénelo hasta 50 mililitros con RPMI 1640. Vuelva a centrifugar la mezcla y vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de RPMI.

Nuevamente, centrifugue la muestra y vuelva a suspender el pellet de celda en 1,5 mililitros de tampón de monocitos frío. A continuación, agregue 250 microlitros de MicroBeads anti CD14 en la suspensión celular e incube durante 15 minutos en hielo. Durante la incubación, prepare una columna de separación conectando un filtro a una rejilla separadora magnética.

Agregue 900 microlitros de tampón de monocitos en la columna para equilibrar. Después de la incubación, vierta la suspensión celular en el filtro y deje que fluya por gravedad hacia un tubo de desechos. Agregue un mililitro de tampón de monocitos para lavar la columna que contiene las células unidas a perlas magnéticas.

Reemplace el tubo de desagüe debajo de la columna con un tubo nuevo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de RPMI. Agregue tres mililitros de tampón de monocitos a la columna. Retire la columna de la rejilla magnética y coloque el sello.

Presione las celdas en el tubo de 50 mililitros preparado y llénelo hasta 30 mililitros con RPMI. Cuente las células utilizando una cámara de recuento de Neubauer bajo un microscopio óptico y ajuste el número de células a dos veces 10 a la potencia de seis células por mililitro con RPMI. Siembre un mililitro de suspensión celular en cada pocillo de una cámara de seis pocillos e incube durante dos a cuatro horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Después de la incubación, verifique si las células se adhirieron correctamente y reemplace el RPMI con 1,5 mililitros de monomedio. Continúe la incubación durante un máximo de seis días hasta que los monocitos se diferencien en macrófagos. Después de derivar macrófagos humanos primarios de las muestras de sangre del donante en una placa de seis pocillos, agregue 500 microlitros de Accutase e incube durante 40 minutos para separar los macrófagos.

Luego agregue 500 microlitros de medio y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros para la centrifugación. A continuación, lavar las celdas una vez con dos mililitros de DPBS y contarlas con una cámara de Neubauer. Diluir el número deseado de macrófagos en 40 microlitros de colágeno que mezclo, y agitar brevemente el tubo.

Para lavar los esferoides, agregue 300 microlitros de DPBS en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Utilice una punta de pipeta azul de un mililitro con un extremo cortado para recoger el esteroide con DPBS. Una vez que el esteroide se asiente en la punta, empuje brevemente la pipeta hasta el fondo de la cámara de imágenes para transferir el esteroide tumoral por tensión superficial.

Elimine la mayor cantidad posible de DPBS residual transferido con el esteroide. Agregue rápidamente 40 microlitros de mezcla de colágeno y macrófagos en la cámara de imagen que contiene esteroides. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en condiciones húmedas para polimerizar completamente la mezcla de colágeno.

Después de la polimerización, agregue con cuidado 25 microlitros de medios de células cancerosas a cada pocillo y continúe la incubación durante tres días. Obtenga una imagen de la muestra viva utilizando un microscopio de escaneo láser en los puntos de tiempo deseados. El área del esferoide H1299 GFP se midió en 40.307 micrómetros cuadrados en el tercer día de invasión, mientras que el perímetro del esferoide fue de 1700,17 micrómetros, lo que indica crecimiento a lo largo del tiempo.

Se observó una invasión colectiva de células cancerosas desde el esferoide y se identificaron 51 partículas aisladas, que sirvieron como indicador de la invasión de células cancerosas individuales. El esferoide mantuvo una relación de aspecto de 1,10 y una circularidad de 0,18, mostrando una baja deformación.