Eliminación eficiente de genes en el hígado a través de la inyección intraesplénica de ARN de horquilla pequeña administrado por virus adenoasociados al serotipo 8 (AAV8)
1 de noviembre de 2024
Este protocolo describe cómo la inyección intraesplénica de ARN de horquilla pequeña administrado por AAV8 logra la misma eficiencia de eliminación de genes en el hígado que la inyección de vena porta, lo que representa un procedimiento más simple con mortalidad y complicaciones perioperatorias y postoperatorias mucho más bajas.
Nuestro enfoque de investigación es mejorar la comprensión de la progresión de trastornos complejos utilizando métodos computacionales y experimentales. Nos enfocamos en desarrollar estrategias para ralentizar o revertir la progresión de enfermedades complejas como trastornos metabólicos, envejecimiento y cáncer. La pregunta clave que estamos tratando de abordar aquí es por qué algunas lesiones precancerosas se convierten en cáncer, por qué algunos tejidos adultos pueden lograr la regeneración después de una lesión y qué está impulsando el proceso de envejecimiento. Estas tecnologías incluyen la secuenciación del genoma completo, la secuenciación de células individuales, el algoritmo computacional y de aprendizaje automático robusto, el modelado de IA y los modelos animales experimentales que son relevantes para las enfermedades humanas. Este protocolo describe un método para la eliminación de genes in vivo mediante inyecciones intraesplénicas de AAV8, administradas en una construcción de ARN de horquilla corta dirigida a la derivación nuclear. El vástago nuclear es un factor de autorrenovación de células madre que desempeña un papel importante en el desarrollo embrionario, el desarrollo del cáncer y la regeneración del tejido adulto. Demostramos que en el trasplante las inyecciones de AAV8 administran ARN de horquilla corta logran la misma eficiencia de eliminación. Un conjunto de inyecciones en la vena porta de AAV8 administran la construcción, pero se asocia con muchas menos complicaciones y el procedimiento es mucho más simple.
[Instructor] Para comenzar, transfiera los ratones anestesiados al área quirúrgica aséptica en una posición recostada lateral derecha. Con una cuchilla quirúrgica, haga una incisión de 15 milímetros en la pared abdominal superior izquierda, seguida de una incisión de 10 milímetros en el peritoneo. Con fórceps, exponga suavemente el bazo y coloque un trozo de gasa húmeda debajo para mantenerlo en su lugar. A continuación, con una aguja de calibre 30, inyecte 50 microlitros de virus AAV8 en el bazo a una profundidad de tres milímetros por debajo de la superficie durante un período de 30 segundos. Luego cubra el sitio con un hisopo de algodón y comprímalo durante un minuto. Luego, sutura la pared abdominal con una sutura absorbible 4-0. Luego cierre la piel con una sutura no absorbible 4-0. Después de anestesiar, los ratones realizan una laparotomía haciendo una incisión en la línea media de la piel y luego en el peritoneo. Coloque una gasa estéril empapada en solución salina estéril en el lado izquierdo del ratón. Con un hisopo de algodón estéril, saque suavemente los intestinos grueso y delgado. Coloque los intestinos encima de una gasa húmeda y cúbralos para evitar que se sequen o entren en contacto con la piel. Luego, con una aguja estéril de calibre 32, inyecte 50 microlitros del virus AAV8 en la vena porta en un ángulo de menos de cinco grados. Inserte la aguja de tres a cinco milímetros en la vena porta y deje que la sangre fluya más allá de la aguja durante cinco segundos para evitar el reflujo. Luego, coloque un hisopo de algodón estéril en el lugar de la inyección y aplique una presión suave hasta que la vena esté completamente cerrada y no se produzca sangrado. Luego, regrese suavemente los órganos internos a la cavidad abdominal. Luego, cierre la pared abdominal con una sutura absorbible 4-0 y la piel con una sutura no absorbible 4-0. Las inyecciones intraesplénicas y de la vena porta mostraron una eficiencia de derribo estadísticamente equivalente del ARNm sin diferencias significativas observadas entre los dos métodos.
Descripción general
Este protocolo describe un método para la inhibición génica in vivo mediante inyecciones intrasplénicas de ARN de interferencia en forma de horquilla corta, administrado mediante AAV8. Este enfoque logra una eficiencia de inhibición génica en el hígado similar a la de la inyección en la vena porta, pero es más sencillo y presenta menos complicaciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Terapia génica
- Neurociencia
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- Comprender las técnicas de silenciamiento génico es fundamental para estudiar enfermedades complejas.
- AAV8 es un vector viral utilizado para entregar material genético.
- Los factores de diferenciación nuclear son importantes en diversos procesos biológicos.
- Minimizar las complicaciones quirúrgicas es esencial para mejorar los resultados experimentales.
Objetivo del estudio
- Comparar la eficacia de las inyecciones intrasplénicas frente a las inyecciones en la vena porta para la inhibición génica.
- Simplificar el procedimiento manteniendo su eficacia.
- Reducir las complicaciones perioperatorias y posoperatorias.
Métodos Utilizados
- Inyección intrasplénica de ARN de interferencia en forma de horquilla corta administrado mediante AAV8.
- Inyección en la vena porta de AAV8 como método comparativo.
- Uso de ratones anestesiados para procedimientos quirúrgicos.
- Análisis estadístico para comparar la eficiencia de silenciamiento génico.
Resultados principales
- Ambos métodos de inyección lograron una eficiencia de silenciamiento génico estadísticamente equivalente.
- La inyección intrasplénica se asoció con menos complicaciones.
- El procedimiento fue más sencillo en comparación con la inyección en la vena porta.
- Los resultados respaldan el uso de la inyección intrasplénica como una alternativa viable.
Conclusiones
- La inyección intrasplénica de AAV8 es un método eficaz para la inhibición génica.
- Este método puede potenciar la investigación en terapia génica y medicina regenerativa.
- Estudios futuros podrían explorar los efectos a largo plazo de esta técnica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inhibición génica eficiente y mínimamente invasiva en el hígado es fundamental para la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en la investigación metabólica, regenerativa y oncológica. El protocolo de administración intrasplénica de AAV8-shRNA permite un silenciamiento génico robusto con menor riesgo del procedimiento, lo que favorece la genómica funcional con alta confiabilidad en modelos relevantes para la enfermedad. Este enfoque agiliza los flujos de trabajo iniciales de descubrimiento y preclínicos al minimizar las barreras técnicas y las complicaciones perioperatorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación funcional de genes diana en la fisiopatología hepática mediante modelos in vivo.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar una silenciación génica fiable con efectos fuera del blanco mínimos.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis sobre la función génica en vías metabólicas y regenerativas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona un sistema validado para generar modelos de silenciamiento génico adecuados para la selección de compuestos posteriores.
- Asegura una reducción reproducible y cuantitativa de la expresión génica, favoreciendo la estandarización de ensayos.
- Reduce la variabilidad del procedimiento, mejorando la escalabilidad y el reutilización de la plataforma para múltiples dianas.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Se alinea con sistemas in vivo relevantes para la enfermedad en la descubrimiento traslacional de biomarcadores.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica al permitir una modulación génica consistente.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al minimizar factores de confusión técnicos y biológicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de AAV8-shRNA intrasplénico se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico, permitiendo una validación eficiente de objetivos y la generación de modelos para la identificación de candidatos principales y estudios traslacionales.
- Biología de Descubrimiento: Acelera la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la inhibición génica rápida in vivo.
- Selección: Proporciona silenciamiento génico reproducible, favoreciendo la preparación de ensayos y la generación de resultados cuantitativos.
- Análisis: Ofrece mediciones estadísticamente robustas de la reducción de la expresión génica para análisis comparativo.
- Investigación Traductiva: Asegura la modulación génica relevante para enfermedades en modelos preclínicos, favoreciendo la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo estandarizado y de baja complejidad, adaptable a distintos genes diana y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, la estandarización y la seguridad del procedimiento en los flujos de trabajo de silenciamiento génico.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al reducir las tasas de fallos técnicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas validadas hacia las fases preclínicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de animales pequeños y manejo de vectores virales.
- Necesita acceso a plataformas de producción de AAV8 y análisis cuantitativo de expresión génica.
- Exige estandarización entre equipos para la ejecución del protocolo y la interpretación de datos.
- Adaptable a diversas dianas génicas, aunque puede requerir optimización para diferentes modelos de enfermedad.
- Las limitaciones potenciales incluyen la inmunogenicidad del vector y las restricciones procedimentales específicas del modelo.
