Name: Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a extraer vesículas extracelulares pequeñas de tejido cerebral humano congelado para identificar biomarcadores de microARN en trastornos neurológicos. Este método eficiente mejora el diagnóstico temprano de enfermedades como la demencia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Aislamiento eficiente de sEV cerebrales a partir de tejido mínimo para el descubrimiento de biomarcadores

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Merck</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mascarilla celular Tinción de membrana plasmática naranja</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo III</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>Columnas ExoSpin y sistemas de</td><td>guía de células</td> tampón Ltd.<td>EX01-50</td><td>Este kit contiene columnas SEC utilizadas en este experimento, tampón de precipitación y PBS libre de EV.</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa Halt (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen Kit de preparación de biblioteca de secuenciación de ARN pequeño</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>Este kit contiene una pequeña caja de reactivos de preparación de ARN con placa de cebador i7 Index.&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Este kit contiene reactivo de lisis de recuperación de ARN de alta calidad (Qiazol), columnas de aislamiento de ARN, tampones de aislamiento (RWT, RPE) y agua libre de ARNasa.</td></tr><tr><td>Kit de Reactivos MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>Este es el Kit de Preparación Illumina</td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulosa, 0.45 &mu; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-humano CD63 Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>Utilizado para el análisis de fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-humano Anticuerpo CD81</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>Utilizado para el análisis de fNTA PE</td></tr><tr><td>/Dazzle 594 anti-humano Anticuerpo CD9</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>utilizado para el análisis de fNTA</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Merck</td><td></td><td></td>Kit</tr> de <tr><td>ensayo de proteínas BCA</td> de 4906845001 Pierce <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td> Kit de ensayo de <td></td> microARN <td>ThermoFisher Scientific</td> 25530049 <td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS kit de ensayo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis y extracción RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNasa</td><td>A ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

aprovechamiento del poder de las cargas de microarn en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

Para confirmar la presencia de BDsEVs, se utilizaron tres técnicas: western blot, NTA y TEM (Figura 3). Los resultados del Western blot (Figura 3A y Archivo Suplementario 1) muestran la presencia de los cinco marcadores positivos (CD9, CD63, CD81, Flot-1 y TSG101) y la ausencia de Calnexina en los sEV (utilizados como control negativo), lo que confirma que no hay contaminación con el contenido celular. Como era de esperar, los homogeneizados cerebrales (BH) muestran más proteínas de las observadas en los sEV para los marcadores analizados. Las imágenes TEM confirmaron la morfología de los BDsEV y su tamaño relativo dentro de la muestra (Figura 3B), lo que se confirmó aún más mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (Figura 3C).
La figura 3C (panel superior) muestra los tamaños de partícula aislados que caen entre 50 y 200 nm. A partir de los datos de NTA, tomando el resultado de la dispersión como el 100% de las partículas representadas, el CMO representa alrededor del 52,35% de las partículas (Figura 3C, panel inferior) que tienen una bicapa lipídica. De estas partículas teñidas con CMO, el 34,66% contenía CD9, el 15,49% CD63 y el 12,01% CD81. Consulte el Archivo Suplementario 2 para ver los datos de control NTA.
Los datos de cuantificación del ARN aislado (Tabla 2) muestran niveles que oscilan entre 3,24 y 8,76 (ng/μL), valores que se normalizaron al generar las bibliotecas de ADNc. Los resultados del ensayo TapeStation (Figura 4) muestran picos principales de alrededor de 120-160 pb, con picos más pequeños por debajo de esto de alrededor de 50 pb y otros picos más pequeños que son más altos de alrededor de 484 pb.
Las comprobaciones de calidad de los datos de secuenciación de próxima generación muestran lecturas de muy alta calidad después del recorte del adaptador (Figura 5A). Todas las posiciones de la secuencia muestran una puntuación Phred de &gt;30, lo que indica tasas de error de menos de 1 en 1000 nucleótidos. La Figura 5B muestra que la mayoría de las secuencias están en torno a los 21-22 pb, coincidiendo con el rango de tamaño esperado para los microARN. A través de un mapeo posterior (usando BowTie2), utilizando la bioherramienta de análisis de flagstat de Samtools, de 1.304.100 secuencias alineadas, 1.116 264 (85%) se mapearon a las regiones de microARN en el genoma humano (build hg38; Tabla 3).
Del total de miRNAs, 808 miRNAs se expresaron a través de las 3 muestras, con 344 miRNAs compartidos entre las tres muestras (~43%), 5 compartidos entre el control 1 y el control 2, 183 compartidos entre el control 1 y el control 3, y 16 compartidos entre el control 2 y el control 3 (Figura 6). A partir de estos datos, los miRNA más expresados en los tres BDsEV son has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p y has-let7i-5p. Del mismo modo, los 5 miARN menos expresados diferencialmente en las muestras de BDsEV (lecturas &gt;10) son has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 y has-miR-505-3p. Todos los recuentos de lecturas brutos y normalizados se dan en el Archivo Suplementario 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
Figura 1: Flujo de trabajo de procesamiento de tejidos. La figura muestra el proceso escalonado para el aislamiento de sEV derivados del cerebro (BDsEV) de secciones de cerebro recién congeladas utilizando cromatografía de exclusión por tamaño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
Figura 2: Flujo de trabajo de aislamiento de ARN de BDsEVs. La figura muestra el proceso escalonado de aislar el ARN total de los BDsEV, incluido el paso previo al tratamiento para eliminar cualquier ARN extracelular utilizando proteinasa K y ARNasa A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
Figura 3: Flujo de trabajo de caracterización de BDsEV. La figura muestra varios métodos para caracterizar los BDsEV. (A) Western blot para detectar marcadores de proteínas específicos de sEV. BH Homogeneizado cerebral. La calnexina es un control negativo para los sEV: la ausencia en el sEV y la presencia en BH confirman la pureza de la muestra del sEV. Para otros marcadores, como se esperaba, la cantidad de proteína es mayor en BH que en las muestras de sEV (20 μg de proteína cargada por pocillo). (B) Imagen representativa de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para BDsEVs a escala de 200 μM, que confirma la morfología esperada con una membrana de bicapa lipídica. (C) Gráfico de distribución de tamaño para el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para todas las partículas (panel superior). Cada punto de datos representa la variación en tres réplicas. Proporciones normalizadas para partículas biológicas (sEVs) y proporciones relativas para marcadores de superficie específicos (panel inferior) (datos mostrados como media ± SEM de pocillos triplicados (n = 3)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
Figura 4: Control de calidad para la preparación de la biblioteca de ADNc. Análisis de cintas para muestras individuales después de la preparación de la biblioteca de ADNc. Los picos que se muestran en cada gráfico muestran el tamaño de cada preparación (eje horizontal, en pb) y la intensidad respectiva de cada pico (eje vertical, FU). Se espera que la pequeña biblioteca de ARN alcance un máximo de alrededor de 120-160 pb, como se ve en la figura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
Figura 5: Control de calidad para la secuenciación de miRnome. (A) Gráfico FASTQC para la calidad de lectura de las muestras individuales después del recorte del adaptador. El eje horizontal es para la posición de los nucleótidos y el eje vertical es para las puntuaciones de Phred. Los diagramas de caja para cada posición muestran la distribución de la puntuación Phred en todas las lecturas para cada posición. Todas las distribuciones dentro de la zona verde confirman datos de muy alta calidad (&gt;Q30) que implican una preparación de muestras de alta calidad. (B) La distribución de la longitud de la secuencia para cada muestra muestra que para las tres muestras, la mayoría de las lecturas fueron de alrededor de 21-22 nucleótidos, el rango de tamaño esperado para el microARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
Figura 6: Superposición de la expresión de microARN en todas las muestras. En el diagrama de Venn se muestra el número de miARN detectados en cada muestra (recuento de lecturas ≥ 10) y los microARN específicos compartidos en más de una muestra. Todas las lecturas sin procesar y normalizadas se muestran en el Archivo Suplementario 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epítopo de anticuerpos</td>
			<td>Factor de dilución del anticuerpo </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratón Anti-CD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratón Anti-CD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratón Anti-CD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiflotillina para ratones 1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratón anti-TSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexina para ratones</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anticuerpo secundario anti-ratón</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Epítopos de anticuerpos utilizados para la caracterización de BDsEVs y sus respectivos factores de dilución. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Muestra</td>
			<td>Concentración de miARN (ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Datos de cuantificación de ARN aislado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Muestra</td>
			<td>Secuencias alineadas</td>
			<td>MiARN mapeado</td>
			<td>Porcentaje (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ejemplo de control 1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ejemplo de control 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ejemplo de control 3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Promedio</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Cantidad de secuencias de miRNA alineadas y mapeadas con éxito. 
Archivo complementario 1: Datos complementarios del análisis de Western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 2: Datos complementarios de control de NTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Recuentos de lectura brutos y normalizados de análisis de expresión de miARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 4: Datos suplementarios de concentración de proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas 

Small extracellular vesicles (sEVs) are crucial mediators of cell-cell communication, transporting diverse cargoes like proteins, lipids, and nucleic ...

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

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Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Los microRNAs desempeñan un papel crucial en el cerebro y son objetivos potenciales para modelar la neurodegeneración. Sin embargo, perturbar los niveles de miARN es un desafío debido a la corta longitud del miARN y la inaccesibilidad del tejido cerebral. Este video presenta un método para el diseño de antagomir y la administración específica del cerebro utilizando un neuropéptido en ratones.

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

El presente protocolo describe una técnica de infusión de microcirugía para ratones, que administra sustancias directamente en el cerebro a través de la arteria carótida interna.

Técnica ratón Microcirugía de infusión para Targeted Sustancia de entrega en el SNC vía La arteria carótida interna

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Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

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Aprende a extraer vesículas extracelulares pequeñas de tejido cerebral humano congelado para identificar biomarcadores de microARN en trastornos neurológicos. Este método eficiente mejora el diagnóstico temprano de enfermedades como la demencia.

Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas (Video) | JoVE Journal

Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas

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