Name: Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo extendidas de células madre germinales en el nicho ovárico de Drosophila melanogaster. Este protocolo permite observar la división asimétrica y la dinámica del espectrosoma durante todo el ciclo celular.

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Agradecemos a Acaimo González Reyes y María Olmedo López por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este estudio ha sido financiado por los PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" de la Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" del VI y VII PPIT-Universidad de Sevilla (P. R-R) y "Contrato de Acceso de I+D+i" del VI PPIT-Universidad de Sevilla (P. R-R). Extendemos nuestro agradecimiento a la Compañía de Biólogos Ltd por proporcionar amablemente los derechos para compartir imágenes adaptadas de la publicación original (doi:10.1242/DEV.199716).

NOTA: El paso 1.4 debe realizarse con al menos 2 días de anticipación. Los pasos 2.1 y 2.2 se pueden realizar con 1 día de anticipación.
1. Configuración pre-experimental I
<ol>
	<li>Prepare 100 μL de alícuotas de la mezcla antibiótica de estreptomicina/penicilina (10.000 U/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina) y almacene a -20 °C hasta su uso.</li>
	<li>Prepare 15 mL de las siguientes soluciones con agua pura esterilizada en autoclave, guárdelas a 4 °C y utilícelas en el plazo de un mes: Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 y 0,1% Tween 20.</li>
	<li>Prepare el siguiente medio de cultivo y la solución en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Use puntas y tubos de filtro esterilizados.
	<ol>
		<li>Prepare 2 mL de suero fetal bovino (FBS) sin diluir y almacene a -20 °C hasta su uso en condiciones asépticas.</li>
		<li>Prepare el medio Drosophila de Schneider suplementado con una mezcla de antibióticos de 15% de FBS y 0,6% de estreptomicina/penicilina. Preparar 7 mL de alícuotas y almacenar a 4 °C. Una alícuota es suficiente para dos placas MatTek (ver sección 2).
		<ol>
			<li>Prepare la solución de Ringer (128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 4 mM de MgCl2, 35,5 mM de sacarosa, 5 mM de Hepes en agua pura esterilizada en autoclave; pH 6,9). Prepare alícuotas de 1 mL y almacene a -20 °C hasta su uso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recoja moscas de 1-2 días de edad que expresen de manera constitutiva y ubicua la proteína Par-1 fusionada con GFP (línea de poli Ubiquitina-mGFP6: :p ar-1) en un nuevo tubo con alimento para moscas suplementado con levadura en polvo. Cultivarlos durante 2 días a 25 °C en una incubadora antes de la disección. 
	NOTA: Este paso se puede realizar con cualquier reportero de interés marcado con fluorescencia.</li>
</ol>
2. Recubrimiento y preparación de la placa inferior de vidrio
<ol>
	<li>Coloque una gota de 3 μL de un adhesivo Cell-Tak específico (en lo sucesivo denominado adhesivo de células y tejidos) en el centro del cubreobjetos de una placa recubierta de poli-D-lisina de 35 mm (placa con fondo de vidrio, consulte la Tabla de materiales) sin esparcir manualmente. Utilice puntas estériles. 
	NOTA: El adhesivo para células y tejidos debe almacenarse a 4 °C. En el caso de experimentos con dos condiciones genéticas (por lo general, condiciones de control y mutantes), coloque dos gotas individuales y bien separadas del adhesivo en la misma placa de fondo de vidrio. Esto asegurará que ambos antecedentes genéticos se visualicen en las mismas condiciones.</li>
	<li>Inmediatamente después, añada un volumen igual (3 μL en esta configuración de protocolo) de 0,1 M de NaHCO3 pH 8,0 con cuidado en la gota adhesiva de 3 μL según lo recomendado por el fabricante y mezcle mediante pipeteo.</li>
	<li>Para una evaporación completa, incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos y luego mantenerla a 4 °C durante la noche para usarla al día siguiente. Alternativamente, incube la placa preparada a 37 °C durante 25 minutos hasta la evaporación completa y proceda directamente al siguiente paso. En ambos casos, mantenga la placa con su tapa. Use puntas estériles.</li>
	<li>Deje que el plato con fondo de vidrio preparado alcance RT colocándolo en el banco durante 15-20 minutos antes de usarlo.</li>
	<li>Lave 3 veces el plato preparado cuidadosamente. Evite tocar y alterar la(s) capa(s) adhesiva(s). En cada lavado, agregue 6 μL de agua pura esterilizada en autoclave y luego elimine el agua con una boquilla limpia para cada uno de los tres lavados para eliminar los residuos de la solución de NaHCO3.</li>
	<li>Permita la evaporación completa del agua colocando la placa limpia y preparada en RT mientras disecciona durante 5-10 min con la tapa puesta para evitar partículas de polvo.</li>
</ol>
3. Disección de ovario de Drosophila y aislamiento y montaje de ovariolos
NOTA: La disección de ovario se realiza en solución de Ringer (en lugar del medio de Schneider) sin FBS para evitar la presencia de proteínas que podrían interferir con la adherencia del tejido de la muestra al adhesivo.
<ol>
	<li>Limpie un plato de disección de tres pocillos, fórceps y agujas de disección con etanol al 70% antes de comenzar.</li>
	<li>Agregue un volumen suficiente (~200 μL) de solución de Ringer en cada uno de los tres pocillos.</li>
	<li>Diseccionar los ovarios de 5 hembras alimentadas con levadura en 200 μL de solución de Ringer en el primer pocillo con la ayuda de dos pares de pinzas siguiendo los procedimientos estándar10,11. Agarra a la hembra de Drosophila en la intersección del tórax y el abdomen con una de las pinzas. Luego, rasgue suavemente la cutícula en la parte posterior del abdomen y tire de la cutícula del abdomen hasta que los dos ovarios queden expuestos.</li>
	<li>Transfiera los ovarios disecados al segundo pocillo para reducir la contaminación con restos de otros tejidos o desechos resultantes de la disección.</li>
	<li>Retire la vaina muscular de 15-20 ovarios con la ayuda de un microscopio estereoscópico (zoom 8X-13.5X) con iluminación de diodo emisor de luz (LED) y pinzas de punta fina. Use un par de pinzas para anclar todo el cuerpo del ovario, y use el segundo para agarrar suavemente una cámara de óvulos en etapa tardía y estírela suavemente hasta que el músculo se rompa y se quede atrás. 
	NOTA: Es fundamental evitar daños en los germarios con solo reducir el contacto con esta parte de los ovarios. Retire las cámaras de huevos más antiguas que las etapas 8-9.</li>
	<li>Transfiera uno por uno los 15-20 ovariolos sin vaina muscular utilizando las pinzas al tercer pocillo que contiene 200 μL de medio de Ringer.</li>
	<li>Humedecer previamente una punta de 20-200 μL con 0,1% de Tween 20 mediante pipeteo. Esto evita la adhesión de los ovariolos a las paredes plásticas de la punta.</li>
	<li>Transfiera 6 μL de la solución de Ringer que contiene los ovariolos sin vaina muscular utilizando una punta prehumedecida a la placa adhesiva preparada (mantenida en RT). 
	NOTA: Evite todo contacto entre la punta y la capa adhesiva para evitar el desprendimiento de germarios después de la deposición de ovariolo (siguiente paso). Aproximadamente el 30% de los germarios no se adhieren como se esperaba.</li>
	<li>Para asegurarse de que los ovariolos transferidos se adhieran a la superficie adhesiva, presiónelos con cuidado hasta el fondo de la gota del Ringer hasta que entren en contacto con la superficie adhesiva con una aguja de disección o pinzas><.
	NOTA: No intente reorganizar los ovarios una vez que se asienten.</li>
	<li>Llene cuidadosamente la placa MatTek con 3 mL de medio de Schneider suplementado con la mezcla de antibióticos 15% de FBS y 0,6% de estreptomicina/penicilina (paso 1.3). Para evitar el desprendimiento de los ovarios, agregue lentamente 1 mL a la vez alrededor del borde exterior de la placa.</li>
	<li>Transporte la placa que contiene los ovarios sin vaina muscular sobre una superficie plana hasta la estación de microscopio.</li>
</ol>
4. Imágenes en vivo usando un microscopio confocal
<ol>
	<li>Coloque la placa en el objetivo de 63x de un microscopio de disco giratorio o un microscopio confocal (se puede utilizar un equipo similar) y enfoque la muestra. Seleccione el plano z central para cada germarium.</li>
	<li>Configure los siguientes parámetros experimentales: tipo de captura: time-lapse 3D, ajuste la potencia del láser de 70/100, longitud de onda de excitación: 488 nm, rango de la pila Z: 30 μm y distancia entre pilas Z: 1,2 μm, duración: 17 h, intervalo entre puntos de tiempo: cada 10 min.</li>
	<li>Si está disponible, utilizando una opción de múltiples posiciones, redefina las coordenadas XY de las muestras y seleccione un plano Z en el centro de cada germario, ya que las pilas Z estarán centradas en esta posición. Iniciar la adquisición. 
	NOTA: Como el ancho normal de un germarium es de 30 μm, cada pila Z tendrá ~25-27 secciones. Dependiendo del confocal, se pueden obtener imágenes de al menos 25 germenios en los intervalos de 10 minutos. Normalmente, se utilizan objetivos de inmersión en aceite de 40x/1,30 NA o 63x/1,40 NA, corregidos por planapo.</li>
	<li>Analice las imágenes en el tiempo y en el eje Z para visualizar cambios específicos en la morfología del espectrosoma utilizando el software Imaris o ImageJ (Fiji)12,13. Se muestran los tiempos específicos de su observación (Figura 1B'). Para montar las películas, seleccione manualmente el mejor plano Z en cada punto de tiempo.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
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<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí presentamos un protocolo para monitorear el nicho GSC de Drosophila melanogaster durante un período prolongado de tiempo, hasta 16 h. La mayoría de los protocolos para filmar los procesos biológicos de Drosophila ex vivo se centran en ventanas de tiempo más cortas y se pueden encontrar múltiples ejemplos para los discos de las alas imaginales 15,16,17, las gónadas embrionarias18,19 o los ovarios 20,21,22,23. Ciertamente, la duración de la adquisición de imágenes depende del proceso de desarrollo bajo escrutinio. Mientras que los eventos transitorios pueden ocurrir en un rango que puede variar de milisegundos a segundos según el tipo de célula y las condiciones fisiológicas24, otros procesos, como la división celular, pueden requerir horas o días de filmación para ser observables. En particular, el ciclo celular de las GSC hembras de Drosophila tarda aproximadamente 12-14 h en completarse25. En Villa-Fombuena et al. (2021)8, la estimación de la duración del ciclo completo fue de 15,5 h, según lo determinado por el estudio de los cambios en la morfología del espectrosoma. La combinación de este método de imagen con marcadores de cromatina y/o la tecnología Fly-FUCCI26 mostró que un GSC se dividía típicamente cada 15,5 h y que las duraciones promedio de las fases del ciclo celular eran: M (forma redonda, 22 min), G1 (formas redondas G1, Plug y Bar, 3,45 h), S (forma fusionada, 43 min) y G2 (fusión, Signo de exclamación y Formas redondas, 10,5 h). Los datos brutos sobre la duración de las fases del ciclo celular se muestran en Villa-Fombuena et al.8. Estas observaciones fueron consistentes con estudios previos que utilizaron imágenes fijas para analizar el ciclo celular de GSC y la morfología del fusoma25,27,28. Además, este método in vivo podría ayudar a descifrar las consecuencias posteriores de la división anormal de GSC y / o la dinámica del espectrosoma en la selección de ovocitos aguas abajo, ya que el fusoma juega un papel importante en estos eventos. Además, este protocolo se puede aplicar para analizar la tasa de división de GSC en mutantes establecidos o nuevos.
La adquisición continua de imágenes durante largas horas implica una serie de cuestiones críticas a tener en cuenta, principalmente el mantenimiento de la integridad del tejido y su funcionalidad y, la preservación de la fluorescencia de la muestra. El mantenimiento de las condiciones ambientales adecuadas de las células de nicho es esencial para evitar el mal funcionamiento, el estrés, la detención del ciclo celular o la muerte celular. En las condiciones de este estudio, las GSC pueden entrar en mitosis, un paso crítico para indicar la salud de los tejidos, incluso después de 12 h o más durante la filmación. Por lo tanto, suponemos que los germarios cultivados mantienen su integridad y funcionalidad durante la mayor parte del tiempo de obtención de imágenes. Del mismo modo, debido a la nueva producción de material GFP:Par-1 (ver Villa-Fombuena et al. 2021)8 a lo largo del ciclo celular, y dado que reducimos la adquisición de imágenes a solo una vez cada 10 minutos, incluso los puntos de tiempo más cercanos al final de las películas retienen suficiente señal para permitir su análisis. En cualquier caso, el blanqueo de muestras puede corregirse potencialmente con complementos como la corrección de blanqueo13.
Para imitar un entorno adecuado ex vivo, los tejidos de insectos se pueden mantener utilizando el medio de Schneider durante un cierto número de horas durante la filmación con suplementos específicos. Es importante destacar que este protocolo no utiliza factores de crecimiento ni extracto de mosca que no sea FBS. Un estudio anterior mostró que muchas GSC normalmente se detienen en G2 y entran en la fase M por niveles altos de insulina25. Por lo tanto, no agregamos insulina a las condiciones de cultivo para evitar esta estimulación anormal del ciclo celular GSC. La adición de FBS al medio de disección también puede reducir la posibilidad de que las cámaras de huevos se adhieran a la punta de la pipeta o a la placa de vidrio durante la transferencia de ovarioles21. Finalmente, el uso de antibióticos es apropiado para películas extendidas para evitar la proliferación bacteriana y/o fúngica. El crecimiento excesivo de microorganismos en las placas de cultivo puede alterar la homeostasis del tejido y, por lo tanto, afectar la división celular. En este protocolo, el medio contiene una mezcla de antibióticos (generalmente suplementados al 1% (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina). Del mismo modo, las incubaciones prolongadas pueden afectar la eficiencia de los antibióticos, y se podría considerar el reemplazo del medio para prevenir la descomposición de los antibióticos.
Drosophila germaria está rodeada por una vaina muscular tubular que es necesario extirpar para evitar los movimientos peristálticos, de rotación y contracción típicos de este tejido29,30. Por lo tanto, la eliminación de esta vaina muscular mejora la observación de las señales indicadoras, permite el uso de configuraciones de configuración confocal para minimizar el blanqueo de la señal y el fotodaño, y permite imágenes de alta resolución de tiempo. En el lado negativo, aún se desconoce la contribución de la vaina muscular a la homeostasis del tejido. Por lo tanto, su eliminación puede afectar de alguna manera el funcionamiento normal del nicho de la SGC. Otro inconveniente del sistema es que los germaria pueden desprenderse del adhesivo durante la filmación y desplazarse en el medio circundante. Por lo tanto, las imágenes pueden cambiar dentro de los puntos de tiempo o incluso durante la adquisición de la serie z dada. Si este es el caso, se pueden usar diferentes complementos para corregir el movimiento de la muestra en ImageJ, como los métodos de registro12.
En resumen, hemos ideado un método para adquirir películas extendidas de germaria en vivo. Si bien este método ha permitido una definición detallada del ciclo celular GSC y cómo la dinámica del espectrosoma se correlaciona con las diferentes fases del ciclo celular GSC, somos conscientes de algunas de las limitaciones inherentes a nuestro protocolo. En primer lugar, la adquisición de imágenes tiene lugar en un medio artificial donde las condiciones ambientales no recapitulan exactamente las condiciones in vivo . Sin embargo, dado que obtuvimos resultados similares con respecto a la morfología del espectrosoma durante las diferentes fases del ciclo celular que los reportados por otros autores utilizando tejido fijo31, creemos que este protocolo recapitula en gran medida las condiciones in vivo . En segundo lugar, aunque la integridad y la funcionalidad del tejido parecen no verse afectadas por los cultivos de 16 horas de duración, no lo hemos evaluado cuidadosamente. Idealmente, se podría trasplantar germaria filmada nuevamente en un abdomen femenino y evaluar si puede producir nuevas cámaras de huevos como lo hacen los germaria de control32. El método de imágenes en vivo utilizado en este estudio es una herramienta valiosa para el análisis de la división asimétrica de GSC, particularmente para la biología ovárica de Drosophila en general. Además, este enfoque es particularmente adecuado para estudios farmacológicos de compuestos químicos, factores de crecimiento o nutrientes, ya que pueden complementarse directamente en los medios de cultivo. Además, podemos colocar muestras experimentales y de control en la misma placa, minimizando las variaciones técnicas dentro de los experimentos.

Las imágenes en vivo de los procesos biológicos son fundamentales para obtener evidencia experimental directa. La combinación de microscopía confocal avanzada y la optimización de metodologías permite la exploración de múltiples eventos biológicos con alta precisión. La optimización de los pasos en protocolos como la manipulación y disección de tejidos, la preparación y conservación de muestras y la configuración de adquisición de microscopía es fundamental para maximizar la fiabilidad y solidez de los resultados obtenidos. Aquí, presentamos un protocolo para monitorear muestras para imágenes extendidas, que está especialmente enfocado en los ovarios de Drosophila melanogaster. El ovario de Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para el análisis de una amplia gama de procesos de desarrollo. Entre muchos otros, este órgano reproductor de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster contiene un nicho de células madre adultas muy bien definido. Este nicho GSC sustenta el desarrollo de los gametos femeninos durante la edad adulta. Los ovarios de Drosophila están compuestos por aproximadamente 18 ovariolos, donde se desarrollan cámaras de huevos en el germarium. En la punta de cada germario, se mantienen 2-4 GSCs en un nicho celular somático formado principalmente por un filamento terminal de 8-10 células, una roseta de 5-8 células de capuchón y 2-3 células de escolta anteriores (Figura 1A). Este nicho somático proporciona a las GSC señales esenciales y apoyo físico para mantener su tallo, controlar la proliferación y prevenir la diferenciación1,2,3,4,5.
Las GSCs normalmente se dividen asimétricamente para generar una nueva célula madre que mantiene contacto con el nicho somático y una célula hija, el cistoblasto (CB), que pierde el contacto directo con las células del capuchón somático y se diferencia. Las GSCs y CBs contienen un orgánulo altamente dinámico y citoplasmático, el espectrosoma, cuya función principal es la correcta orientación del huso mitótico durante la mitosis6. El CB se divide 4 veces con citocinesis incompleta para desarrollar quistes de 16 células, donde una de las células de la línea germinal se especifica en el ovocito y las otras 15 células se convierten en células nodrizas. El espectrosoma CB se convierte en una estructura ramificada llamada fusoma, que conecta las células germinales interconectadas de 16 células. El espectrosoma está enriquecido en pequeñas vesículas y proteínas esqueléticas como la serina-treonina quinasa Par-1 y el componente de membrana Hu-li tai shao (Hts)7. Durante el ciclo celular GSC, el espectrosoma crece por la adición de nuevo material y cambia su forma, lo que permite la identificación de las fases G1, S, G2 y M (Figura 1B)8,9.
Recientemente hemos implementado un método de cultivo ex vivo del germarium de Drosophila que permite obtener imágenes de GSCs vivas durante un máximo de 16 h. Dado que estas células se dividen una vez cada 15,5 h en promedio8, este método permite la filmación de grandes porciones del ciclo celular GSC. Así, en combinación con otras herramientas, nuestro método de cultivo ha permitido la descripción de la morfología del espectrosoma durante el ciclo celular GSC y el análisis de la duración de las diferentes fases del ciclo celular in vivo8 (Figura 1C). Aquí, proporcionamos un protocolo detallado de este método de imágenes en vivo extendido respaldado por un video guiado paso a paso que describe la metodología (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Placa de vidrio de 9 pocillos</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; Para preparar la solución de Ringer</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Adhesivo para células y tejidos utilizado para unir células o secciones de tejido a muchos tipos de superficies, incluyendo plástico, vidrio, metal, polímero FEP y materiales biológicos.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Dimensiones 0,05 mm x 0,02 mm y longitud 11 cm</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Calificado, inactivado por calor, aprobado por la UE, Origen de América del Sur&nbsp;</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C Plato de</td><td>35 mm, No. 1.5 Cubreobjetos, 10 mm Diámetro de vidrio,&nbsp; HEPES recubierto de poli-D-lisina</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Para preparar la solución de Ringer</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Para preparar la solución de Ringer,</td></tr><tr><td>portaagujas</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Mango liviano y hueco de acero inoxidable; 4 3/4" de largo.</td></tr><tr><td>Prismáticos Nikon SMZ18&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Para preparar la solución de Ringer</td></tr><tr><td>, Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>Medio de cultivo celular para células de insectos</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge; 99,5%,</td></tr><tr><td>cloruro de sodio en</td> polvo <td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Para preparar la solución de Ringer,</td></tr><tr><td>sacarosa,</td><td>Sigma, Aldrich,</td><td>S9378</td><td>&ge; 99,5% (GC); Para preparar la solución de Ringer,</td></tr><tr><td>aguja de disección de tungsteno</td><td>, Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, ultrafino, punta de 1 micra (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>para biología molecular, líquido viscoso</td></tr><tr><td>Levadura en polvo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Los métodos de imagen en vivo permiten el análisis de procesos celulares dinámicos en detalle y en tiempo real. El ovario de Drosophila representa un excelente modelo para explorar la dinámica de una miríada de procesos de desarrollo, como la división celular, la madre, la diferenciación, la migración, la apoptosis, la autofagia, la adhesión celular, etc., a lo largo del tiempo. Recientemente, hemos implementado un cultivo ex vivo extendido e imágenes en vivo del nicho GSC femenino de Drosophila. Utilizando como ejemplo una línea de Drosophila que alberga un transgén GFP::P ar-1, este método permite la visualización de la división asimétrica de las GSCs dentro de su nicho y la descripción de los cambios en la morfología del espectrosoma a lo largo del ciclo celular. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el cultivo ex vivo de Drosophila germaria, lo que permite la visualización prolongada del nicho femenino de GSC. Es importante destacar que este protocolo es ampliamente aplicable a las GSC de imágenes en vivo con múltiples proteínas de interés marcadas con fluorescencia que están disponibles en los centros de almacenamiento y/o en la comunidad de investigación de Drosophila.

Con este protocolo extendido de imagen en vivo, podemos registrar la mitosis asimétrica de las CSG femeninas dentro de su nicho sin perturbaciones biológicas aparentes. Para ello, utilizamos germarios que expresan de forma ubicua la proteína GFP::Par-1, la cual permite distinguir entre cinco morfologías distintas del espectrosoma a lo largo del ciclo celular de las CSG: Redonda, Tapón, Barra, Fusión y Signo de exclamación (Figura 1B,C). En una descripción más detallada, observamos que la señal intensa de GFP::Par-1 del espectrosoma Redondo-G2 (Figura 1C, panel a) se reduce drásticamente durante las fases G2-M-G1. Es importante destacar que el uso de esta línea transgénica también permite visualizar la entrada de las CSG en mitosis, ya que la mayor parte del GFP::Par-1 abandona el espectrosoma y llena el citoplasma durante la profase temprana (Figura 1C, panel b). Además, el GFP::Par-1 citoplasmático permite la detección precisa del paso de permeabilización del envoltorio nuclear (NEP)8,14, momento en el cual la señal de GFP entra en el nucleoplasma (Figura 1C, panel b). Tras la mitosis y la reconstitución del envoltorio nuclear, la señal de GFP::Par-1 se recupera gradualmente en el espectrosoma Redondo-G1 (Figura 1C, panel c). La adición de novo de material GFP::Par-1 al espectrosoma Redondo-G1 promueve la formación de las morfologías de espectrosoma Tapón (Figura 1C, panel d), Barra (Figura 1C, panel e) y Fusión (Figura 1C, panel f). Finalmente, el marcador GFP::Par-1 permite visualizar el espectrosoma en forma de signo de exclamación (Figura 1C, panel e), como consecuencia de la formación del cuerpo medio, una estructura proteica rica en microtúbulos que se forma durante la citocinesis junto con el anillo contráctil de actomiosina.
<img alt="Fases de diferenciación de células madre germinales; morfología del espectrosoma; diagrama de fases del ciclo; microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinámica del ciclo del espectrosoma en células madre germinales (GSC) vivas. (A) Diagrama esquemático del nicho de células madre germinales (GSC, por sus siglas en inglés), compuesto por células del filamento terminal (TFCs, en azul), la célula de transición (TC, en rojo), células tapón (CpCs, en morado) y células de acompañamiento (ECs, en gris). Las GSC (en amarillo) contienen un orgánulo característico denominado espectrosoma (en verde). Durante el ciclo celular de la GSC, el espectrosoma pasa de una forma esférica a una alargada y luego vuelve a ser esférico. La GSC se divide para generar una célula hija, el cistoblasto (CB, en naranja), que pierde contacto con el nicho y que también contiene un espectrosoma esférico. El CB se divide cuatro veces consecutivas y de manera sincrónica con citocinesis incompleta para producir quistes de 2, 4, 8 y 16 células interconectadas por el fusoma. (B) Diagrama que representa las diferentes formas del espectrosoma generadas durante el ciclo celular. (B') Tiempo esperado para la observación de las morfologías del espectrosoma. (C) Imágenes por puntos temporales de una película de 17 h que muestra la señal GFP::Par-1 en el nicho de GSC. El tiempo 0 min (0') corresponde a la permeabilización de la envoltura nuclear (NEP, por sus siglas en inglés). El panel ilustra cinco morfologías diferentes del espectrosoma (flechas blancas y verdes): redondo (tanto en G2 como en G1; paneles a y c), tapón (panel d), barra (panel e), fusión (panel f) y signo de exclamación (panel e, flecha verde). Esta última morfología del espectrosoma pertenece a la segunda GSC (línea punteada verde) mostrada a los 70'. Las GSC están delimitadas por líneas punteadas amarillas y verdes. Las CB resultantes tras la división de la GSC están delimitadas con líneas punteadas naranjas. Barra de escala: 10 µm. Los paneles A y B fueron adaptados con autorización de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de aislamiento de ovariólos de Drosophila; pasos: preparación MatTek, disección, obtención de imágenes; método biológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Método de montaje con adhesivo Cell-Tak para la obtención de imágenes en vivo prolongadas de los gónadas de Drosophila. (1) Proceso paso a paso para preparar el recipiente con fondo de vidrio utilizando el adhesivo. (2) Vista general de la disección del ovario de Drosophila en solución de Ringer y la preparación individual de ovariólos libres de músculo. (3) Transferir los ovariólos sin la vaina muscular al recipiente con fondo de vidrio. (4) Llenar el recipiente con fondo de vidrio con medio Schneider suplementado. (5) Obtener imágenes de las gónadas durante 10 a 16 horas utilizando un microscopio confocal invertido. Esta figura fue adaptada con permiso de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Aprende a realizar imágenes en vivo extendidas de células madre germinales en el nicho ovárico de Drosophila melanogaster. Este protocolo permite observar la división asimétrica y la dinámica del espectrosoma durante todo el ciclo celular.

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