Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas
27 de septiembre de 2024
Este protocolo tiene como objetivo platear de manera estable ensamblajes fusionados dorsal-ventral en matrices de electrodos múltiples para modelar la epilepsia in vitro.
En las últimas décadas, una explosión de descubrimientos genéticos ha identificado cientos de genes que causan o están asociados con la epilepsia. Sin embargo, los mecanismos patogénicos no están tan bien explorados. Nuestro laboratorio estudia cómo los cambios genéticos afectan el desarrollo temprano del cerebro y dan lugar a malformaciones cerebrales y epilepsia, una enfermedad debilitante caracterizada por convulsiones crónicas.
Las epilepsias genéticas se han estudiado típicamente utilizando modelos animales, incluidos ratones, peces cebra, drosófila y conejos. Las células madre humanas se han utilizado más recientemente para modelar epilepsias genéticas a medida que han avanzado las técnicas para diferenciar las células madre en tejido neurológico. Con el advenimiento de los organoides cerebrales, se pueden recapitular los aspectos estructurales del desarrollo cerebral.
La medición de la actividad electrofisiológica y la determinación de biomarcadores de la actividad relacionada con la epilepsia a partir de organoides y ensambles cerebrales es un desafío. En parte, esta técnica es limitada porque los organoides cerebrales no pueden tener convulsiones como un animal intacto. No obstante, encontrar diferencias electrofisiológicas en este modelo in vitro y respuestas a los tratamientos farmacológicos puede ayudar a determinar los mecanismos patológicos y las respuestas terapéuticas en las epilepsias genéticas.
La actividad electrofisiológica se puede evaluar utilizando registros tradicionales de escalada de parches, registros de campo local con electrodos y técnicas ópticas como imágenes de calcio y voltaje de memoria. El uso de registros de matriz de electrodos múltiples tiene la ventaja de poder realizar dos grabaciones a lo largo del tiempo y grabar desde múltiples ubicaciones de un ensamblaje simultáneamente.
Descripción general
Este protocolo describe la siembra estable de assembloides fusionados dorsoventrales en matrices de electrodos múltiples (MEA) para modelar la epilepsia in vitro. Aborda los desafíos en la medición de la actividad electrofisiológica y en la comprensión de los mecanismos patológicos de las epilepsias genéticas mediante organoides cerebrales derivados de células madre humanas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre epilepsia
- Neurodesarrollo
Antecedentes
- Los descubrimientos genéticos han identificado numerosos genes asociados con la epilepsia.
- Los mecanismos patógenos permanecen poco explorados a pesar de los avances en modelado.
- Las células madre humanas y los organoides cerebrales han surgido como modelos para estudiar las epilepsias genéticas.
- La medición de la actividad neuronal en organoides es limitada en comparación con modelos animales intactos.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo para la siembra estable de assembloides en MEAs.
- Investigar las diferencias electrofisiológicas observadas en los modelos in vitro.
- Evaluar las respuestas a tratamientos farmacológicos en la modelización de epilepsias genéticas.
Métodos Utilizados
- Utilización de matrices de electrodos múltiples (MEAs) para grabaciones electrofisiológicas.
- Modelado con assembloides fusionados dorsoventrales derivados de células madre humanas.
- Los pasos críticos incluyen el pretratamiento de la superficie de la MEA, la preparación de los pozos y la colocación del assembloide.
- Observación de la maduración neuronal a lo largo del tiempo con evaluaciones de la actividad de la red.
Resultados principales
- Se observó un aumento en la duración de las ráfagas de red a medida que las neuronas maduraban.
- Se monitorearon los cambios en la actividad celular y de red a lo largo del tiempo, que finalmente desaparecieron al día 125.
- La evaluación de las respuestas a fármacos podría ayudar a descubrir los mecanismos patológicos de la epilepsia.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un método robusto para modelar la epilepsia in vitro utilizando assembloides en MEA.
- Los hallazgos permiten investigaciones detalladas sobre la patología y las respuestas al tratamiento de las epilepsias genéticas.
- Los conocimientos obtenidos podrían mejorar la comprensión de los mecanismos neuronales asociados con la epilepsia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los assembloides cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas cultivados en matrices multielectrodo (MEA) permiten mediciones longitudinales y no destructivas de la actividad de redes neuronales relacionadas con la epilepsia. Esta plataforma aborda la brecha traslacional entre el descubrimiento genético y la comprensión mecanicista al proporcionar un sistema escalable y específico del ser humano para la interrogación funcional y el perfilado de respuesta a fármacos. El enfoque respalda una confianza predictiva en la validación temprana de objetivos y orienta decisiones de cartera ajustadas al riesgo para el desarrollo de neuroterapéuticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación funcional de variantes genéticas implicadas en epilepsia mediante circuitos neuronales derivados de humanos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al revelar fenotipos a nivel de red y patrones de actividad anómalos.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de la integración neuronal excitadora e inhibitoria.
- Proporciona una plataforma para evaluar el impacto de intervenciones candidatas sobre la dinámica de red relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo electrofisiológico robusto y longitudinal para cuantificar la actividad de la red durante períodos prolongados.
- Permite la medición reproducible de potenciales de campo, picos y patrones de ráfagas en múltiples assembloides.
- Posibilita la preparación estandarizada de sistemas neuronales complejos en 3D para ensayos posteriores de cribado de compuestos.
- Facilita la adquisición escalable y multiplexada de datos para el análisis comparativo de las respuestas a fármacos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Correlaciona fenotipos de redes in vitro con biomarcadores relevantes para enfermedades en la investigación de la epilepsia.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica en un contexto específico del ser humano.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos neuroterapéuticos basado en lecturas funcionales.
- Permite la evaluación mecanicista de intervenciones terapéuticas en un sistema controlado y escalable.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
Esta plataforma de assembloides basada en MEA conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir la validación funcional de dianas, el desarrollo de ensayos y la alineación de biomarcadores traslacionales en la modelización de la epilepsia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación de los efectos a nivel de red de perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Selección: Proporciona salidas electrofisiológicas cuantitativas y reproducibles adecuadas para la evaluación de compuestos y la normalización de ensayos.
- Análisis: Permite la medición longitudinal de ráfagas en red, maduración y respuesta a fármacos para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Alinea fenotipos in vitro con mecanismos de enfermedad, apoyando decisiones preclínicas guiadas por biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y adaptable para modelar diversas regiones cerebrales y condiciones neurológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la epilepsia.
- Valor operativo: Estandariza ensayos neuronales complejos para lograr reproducibilidad y escalabilidad entre distintos equipos de I+D.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción (go/no-go) y la eficiencia del capital al proporcionar datos funcionales humanos en fases tempranas del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y promoción con ajuste de riesgo de activos neuroterapéuticos basándose en evidencia funcional robusta.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diferenciación de células madre, cultivo de organoides y configuración de ensayos electrofisiológicos.
- Exige acceso a instrumentación de matriz de electrodos múltiples e infraestructura analítica para la adquisición de datos de alto contenido.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de siembra, mantenimiento y análisis de datos.
- Es adaptable a organoides específicos de diversas regiones cerebrales, aunque puede requerir optimización para diferentes tipos de tejido.
- La estabilidad del cultivo y de las grabaciones a largo plazo es fundamental para estudios longitudinales confiables.
