Name: Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:57:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprende a modelar la epilepsia in vitro utilizando matrices de electrodos múltiples con ensamblados cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas. Este método permite registrar la actividad electrofisiológica y evaluar respuestas a fármacos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Registro de la actividad de la red en ensamblajes cerebrales: enfoque de matriz de electrodos múltiples

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+analyses+of+single-cell+transcriptomes+from+multiple+brain+organoids+and+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Synthetic analyses of single-cell transcriptomes from multiple brain organoids and fetal brain.</a> Cell Rep. 30 (6), 1682-1689.e3 (2020).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembloid+CRISPR+screens+reveal+impact+of+disease+genes+in+human+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment.</a> Nature. 622 (7982), 359-366 (2023).</li>
<li>Samarasinghe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+oscillations+and+epileptiform+changes+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of neural oscillations and epileptiform changes in human brain organoids.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1488-1500 (2021).</li>
<li>Saleem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+hyperexcitability+in+human+cerebral+cortical+organoids%3A+Oxygen%2Fglucose+deprivation+most+effective+stimulant%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Modelling hyperexcitability in human cerebral cortical organoids: Oxygen/glucose deprivation most effective stimulant.</a> Heliyon. 9 (4), e14999(2023).</li>
<li>Saberi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+engineered+human+cerebral+tissues+mimic+pathological+circuit+disturbances+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">In-vitro engineered human cerebral tissues mimic pathological circuit disturbances in 3D.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).</li>
<li>Bagley, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fused+dorsal-ventral+cerebral+organoids+model+complex+interactions+between+diverse+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fused dorsal-ventral cerebral organoids model complex interactions between diverse brain regions.</a> Nat Methods. 14 (7), 743-751 (2017).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Sloan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nat Protoc. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally-specified+hPSC-derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally-specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398.e7 (2017).</li>
<li>VanDersarl, J. J., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+surface+patterning+for+long-term+transmembrane+access%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomimetic surface patterning for long-term transmembrane access.</a> Sci Rep. 6 (1), 32485(2016).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Hartmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+different+brainsphere+models+for+use+in+neurotoxicity+testing+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of different brainsphere models for use in neurotoxicity testing on microelectrode arrays.</a> Cells. 12 (9), 1270(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+advanced+cerebellar+organoids+for+neurogenesis+and+neuronal+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Generation of advanced cerebellar organoids for neurogenesis and neuronal network development.</a> Hum Mol Genet. 32 (18), 2832-2841 (2023).</li>
<li>Fair, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+of+cerebral+organoids+correlates+with+dynamic+morphological+and+cellular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation of cerebral organoids correlates with dynamic morphological and cellular development.</a> Stem Cell Rep. 15 (4), 855-868 (2020).</li>
<li>Muzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-derived+cortical+neurospheroids+coupled+to+passive%2C+high-density+and+3D+MEAs%3A+A+valid+platform+for+functional+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human-derived cortical neurospheroids coupled to passive, high-density and 3D MEAs: A valid platform for functional tests.</a> Bioeng. (Basel). 10 (4), 449(2023).</li>
<li>Hruska-Plochan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+neural+networks+reveals+NPTX2+pathology+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A model of human neural networks reveals NPTX2 pathology in ALS and FTLD.</a> Nature. 626 (8001), 1073-1083 (2024).</li>
<li>Reumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+human+dopaminergic+system+using+spatially+arranged+ventral+midbrain-striatum-cortex+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids.</a> Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).</li>
<li>Fenton, T. A., et al. Hyperexcitability and translational phenotypes in a preclinical model of SYNGAP1 mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFenton%2C+TA+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell+microelectrode+arrays+%28MEAs%29+for+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids.</a> Sci Adv. 8 (33), eabq5031(2022).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+establish+subcortical+projections+in+the+mouse+brain+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids establish subcortical projections in the mouse brain after transplantation.</a> Mol Psychiatry. 26 (7), 2964-2976 (2021).</li>
<li>Patton, M. H., et al. Synaptic plasticity in human thalamocortical assembloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatton%2C+MH+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Osaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+activity+and+short-term+plasticity+of+human+cerebral+organoids+reciprocally+connected+with+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complex activity and short-term plasticity of human cerebral organoids reciprocally connected with axons.</a> Nat Commun. 15 (1), 2945(2024).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569.e7 (2019).</li>
<li>Schröter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+brain+organoids+using+high-density+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays.</a> MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).</li>
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<li>Ciarpella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+organoids+develop+network+of+functional+neurons+and+hippocampal+brain+region+identity%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral organoids develop network of functional neurons and hippocampal brain region identity.</a> iScience. 24 (12), 103438(2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+brain+region-specific+organoids+for+investigating+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Development and application of brain region-specific organoids for investigating psychiatric disorders.</a> Biol Psychiatry. 93 (7), 594-605 (2023).</li>
<li>Andersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+3D+cortico-motor+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids.</a> Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).</li>
<li>Atamian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebellar+organoids+with+functional+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells.</a> Cell Stem Cell. 31 (1), 39-51.e6 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 cm Corning Placas de cultivo no tratadas con TC</td><td>Corning</td><td>08-772-32</td><td>Para cultivo en suspensión en el agitador</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100100</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapttoetanol (&beta;-ME)</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td>Concentración de trabajo 100 &mu; Placa</td></tr><tr><td>de cultivo celular M de 48 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-140</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>Fisher Scientific</td><td>501974754</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14R Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>BE-AX14R</td><td></td></tr><tr><td>Allopregnanolone</td><td>Cayman</td><td>16930</td><td>Suspendido 5mg en DMSO para obtener 1 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 80 °C. Diluir a 1:10.000 para su uso. Concentración de trabajo 100 nM.</td></tr><tr><td>Contador celular automatizado</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos Axion CytoView MEA&nbsp;</td><td>Axion Biosystems</td><td>M384-tMEA-6B</td><td></td></tr><tr><td>Axion Maestro Plataforma MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>Maestro</td><td>Con control ambiental de temperatura</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 (regular, con vitamina A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>suplemento B-27 (sin vitamina A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal- Geltrex</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>Baño de perlas</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-876-001</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Microscopio invertido de sobremesa</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Mantenido en flujo laminar banco limpio</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td>Concentración de trabajo 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>CLOROX</td><td>67619-26</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de borato 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>28341</td><td>Concentración de trabajo a 1x</td></tr><tr><td>medio BrainPhys</td><td>StemCell Technologies</td><td>5790</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación celular (StemPro Accutase)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Celltron agitador orbital</td><td>HT-Infors</td><td>&nbsp; I69222&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Detergente/enzima (Terg-A-Zyme)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>Concentración de trabajo 1% m/v</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>113300</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5499</td><td>Disuelva 5 mg en DMSO para obtener 10 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:2000 para su uso. (concentración de trabajo 5 &mu; M)</td></tr><tr><td>D-PBS sin calcio o magnesio</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Disolución 100 &mu; g en 1 ml de PBS a 100 &mu; g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Elección Microscopía Sciences</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Heraguard ECO Clean Bench</td><td>Thermo Fisher</td><td>51029692</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular con control de humedad</td><td>Thermo Fisher</td><td>370</td><td>ajustada a 37 &grados; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Selleckchem</td><td>S7085</td><td>Alícuota y congelar a &menos; 80 °C. Precipitará si se descongela a temperatura ambiente. Las alícuotas congeladas deben colocarse directamente en 37 &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout (KOSR)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>mTeSRplus (medio + suplementos)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td>cGMP, medio estabilizado sin alimentador para células iPSC humanas</td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>Disolución 100 &mu; g en 1 ml de PBS a 100 &mu; g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>NuFF Fibroblastos del prepucio neonatal humano</td><td>MTI-GlobalStem</td><td>GSC-3002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>(P10, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>EP4926000034</td><td>Puntas P1000 cortadas en autoclave para la recogida de organoides</td></tr><tr><td>Poli (etileneimina) (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Diluir el caldo en tampón de borato estéril. Concentración de trabajo 0,07%. Ver detalles en manuscrito.</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) recombinanteR</td><td>& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>suspendido en PBS. Alícuota y congele a -20 °C.</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos humanos (FGF) recombinante-básico&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>suspendido en PBS. Alícuota y congele a -20 °C.</td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro humano (BDNF) recombinantePeprotech</td><td></td> <td>450-02</td><td>Centrífuga brevemente antes de la reconstitución. Disolver 100 &mu; g en 1 ml de PBS a 100 &mu; g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>Ácido retinoico (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Disuelva 100 mg en 3,3 ml de DMSO para obtener 100 mM de solución madre. Alícuota de la acción 100 &mu; L/tubo y congelar a &menos; 80 °C. Toma 200 &mu; L de 100 mM de caldo y diluya 10x (agregue 1,8 ml de DMSO) para hacer 10 mM de stock. Alícuota 50 &mu; L/tubo y almacenar en &menos; 80 °C. Diluir a 1:100.000 para su uso. (concentración de trabajo 100 nM).</td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>1:200 de 10 mM</td></tr><tr><td>SAG (agonista suavizado)</td> <td>Selleckchem</td><td>S7779</td><td>Alícuota y congelar a &menos; 80 &deg;C. Concentración de existencias 1mM. Utilizar a 1:10.000 diluciones (concentración de trabajo 100 nM).</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td>Disuelva 5 mg en 1,3 ml de DMSO para obtener 10 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 80 °C. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 &mu; M)</td></tr><tr><td>Llenadora de pipetas serológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-166</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior de tubo de vacío Steriflip</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Campanas de cultivo celular estériles</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>Solución azul de tripano (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Zoom</td><td>Olympus</td><td>SZ61/SZ51</td><td>Mantenido en banco de limpieza de flujo laminar</td></tr></tbody></table>

una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

Los ensamblajes dorsal-ventrales humanos se colocaron en una placa MEA de 6 pocillos (n = 6 por diferenciación, 3 diferenciaciones), y cada pocillo contenía 64 electrodos (Figura 2A). Nueve de los diez ensamblajes planeados para el registro longitudinal estuvieron firmemente unidos a los electrodos durante más de 50 días in vitro (Figura 2D). 6 de los 8 ensambles designados para ensayos farmacológicos se resolvieron con éxito a través de la fase de lavado con una actividad de red apropiada para la etapa de desarrollo (Figura 2E). Se muestran imágenes de contraste de fase y fluorescencia de un pocillo representativo (Figura 2B), en el que se distinguen fácilmente los organoides dorsales marcados con AAV-CAG-tdTomato y los organoides ventrales marcados con AAV-mDLX-GFP 7,9.
La actividad de las neuronas en un MEA se puede analizar para evaluar la excitabilidad celular general y la actividad de la red, a través de una variedad de parámetros. Las tasas generales de disparo en todo el cultivo proporcionan información sobre la excitabilidad celular y de la red, mientras que la frecuencia de ráfagas sincronizadas a través de múltiples electrodos indica el rango de redes de neuronas sinápticamente activas. Múltiples picos repetidos que ocurren a través de electrodos espacialmente distintos durante un corto período de tiempo (estallido de la red) pueden servir como un correlato biológico para la actividad similar a las convulsiones, aunque los ensamblajes en los MEA siguen siendo limitados en comparación con un organismo completo que puede tener convulsiones de buena fe . La Figura 2C ilustra los patrones de estallido de la red de ensamblajes cultivados en medios basales neurofisiológicos disponibles comercialmente en los días 84 y 91, con un aumento de la duración del estallido en el punto de tiempo posterior probablemente debido a la maduración funcional de las neuronas. En este caso, la actividad celular y de la red aumenta gradualmente desde el día en que se platean los ensamblajes, generalmente alcanzando su punto máximo en el día 92 y casi desvaneciéndose en el día 125 (Figura 2D). Es probable que el aumento de la maduración en la etapa posterior contribuya a la duración prolongada de la ráfaga sincronizada en el punto temporal de grabación posterior.
La bicuculina, un antagonista del receptor GABAA , mejora la actividad sincronizada de la red de los ensamblados, como lo demuestran las tasas de disparo significativamente más altas y las frecuencias de ráfaga (de red) después de agregar el fármaco en el día 108 (Figura 2E). Esto es similar a lo que se ha demostrado previamente en registros de electrofisiología de una sola célula21. Se realizó un análisis de potencia para el ensayo farmacológico utilizando G*Power3 basado en un tamaño del efecto de 0,94 y un alfa de 0,05. Se requirió una muestra total de 15 ensamblajes con tres grupos de igual tamaño de n = 5 para lograr una potencia de 0,8 (Figura 2E). Se incluye un control del vehículo para verificar que la respuesta es un verdadero evento de señalización y no simplemente un cambio en la intensidad de la señal que puede surgir de la adición de una pequeña cantidad de medios (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig01.jpg"> Figura 1: Resumen del estudio. Protocolo para la generación y colocación de ensamblajes marcados duales en MEA cronología del protocolo de diferenciación que detalla las etapas críticas y los suplementos de moléculas pequeñas correspondientes (para obtener información adicional sobre la composición, consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig02.jpg"> Figura 2: Registro de ensamblajes de MEA. (A) Mapa de calor de la actividad media de disparo de una sola placa MEA (n = 6 pocillos) en el día 82, es decir, el día 10 posterior al recubrimiento. Todos los pozos representan cultivos de la misma condición y genotipo. (B) Imágenes representativas de contraste de fase y confocales del ensambladoide, con el ensambloide dorsal marcado con rojo y ventral con verde. Las puntas de flecha blancas indican interneuronas GABAérgicas migradas desde el lado ventral al dorsal. Barra de escala = 500 μm. (C) Trazados ráster representativos durante 120 s de tiempo de registro de un solo pozo. Las ráfagas de red se resaltan con un cuadro morado. Se muestran dos puntos de tiempo separados, el Día 78 (1 semana después de la siembra, día de inicio de la grabación) y el Día 92 (3 semanas después de la siembra, también cuando la actividad alcanza su punto máximo). (D) Cuantificación de las velocidades medias de disparo, la frecuencia de ráfaga y la frecuencia de ráfaga de la red desde el día 78 hasta el día 127 (n = 3 diferenciaciones, 3 ensamblajes/diferenciación). Cada curva indica un ensamblaje individual, compilado a partir de 3 diferenciaciones (codificadas por colores). La curva roja muestra el valor medio. (E) Cuantificación de los resultados del ensayo de bicucullina (n = 6 ensambles/condición). El gráfico de barras se mostró como media ± SEM. Cada punto representa un ensamblado, compilado a partir de 3 lotes de diferenciación (codificados por colores). Se realizó una prueba de Friedman no paramétrica. **p &lt; 0,01; ns, no significativo. MEA, matrices multielectrodos. El mapa de calor y los gráficos ráster se generan utilizando el software analítico Neural Metric Tool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Componentes de los medios en diversas etapas de diferenciación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

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El video demuestra cómo usar una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs). Se registra la actividad electrofisiológica de un MEA multipocillo que contiene un cocultivo neurona-astrocito para detectar potenciales de acción de múltiples neuronas en la red, lo que confirma la diferenciación exitosa de las hiPSC en neuronas.

Medición de la actividad electrofisiológica de las redes neuronales mediante matrices de microelectrodos

Este video muestra el procedimiento de uso de la matriz de electrodos múltiples (MEA) para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo 3D. Este método permite comprender la dinámica de la red neuronal y la actividad de ráfaga de la red sináptica dentro de las esferas 3D.

Utilización de matrices de electrodos múltiples para medir la fisiología sináptica en esferas de cocultivo en 3D

Este protocolo implica el uso de una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad eléctrica en un corte de cerebro expuesto a una droga inductora de convulsiones. El procedimiento incluye la colocación del corte de cerebro en una cámara de registro MEA, la aplicación de estimulación eléctrica para inducir convulsiones artificiales y el análisis de las señales resultantes.

Monitorización de la actividad eléctrica neuronal inducida por convulsiones en cortes de cerebro mediante matrices de microelectrodos

Estamos aquí describimos cómo realizar múltiples grabaciones de electrodos de matriz de tejido cortical humano epiléptico. Resección del tejido epiléptico, preparación rebanada y matriz de electrodos múltiples grabaciones de eventos interictales y ictales se demuestran en detalle.

Multi-electrodos Grabaciones variedad de epilepsia humana postoperatoria cortical del tejido

La caracterización electrofisiológica de los cardiomiocitos derivados de las células madre pluripotentes humanas (hPSC-CMs) es crucial para el modelado de la enfermedad cardiaca y para la determinación de las respuestas de los fármacos. Este protocolo proporciona la información necesaria para disociar y planificar hPSC-CM en arrays de múltiples electrodos, medir su potencial de campo, y un método para analizar intervalos QT y RR.

Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

Hemos diseñado un procedimiento en el que un cadáver humano formaldehído-fija se utiliza para ayudar a los neurocirujanos en formación para la implantación de arreglos de microelectrodos en el Neocórtex del cerebro humano.

Formación quirúrgica para la implantación de microelectrodos Neocortical matrices usando un modelo de cadáver humano formaldehído-fija

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos la preparación de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Bajo una privación gradual y controlada del suero, estas rebanadas representan la evolución epiléptica-como acontecimientos y se pueden considerar un modelo ex vivo del epileptogenesis. Este sistema representa una excelente herramienta para monitorear la dinámica de la actividad espontánea, así como para evaluar la progresión de las características neuroinflamatorias a lo largo del curso de la...

Un Modelo De Epileptogénesis En La Corteza Rinal-Hipocampo Organotípica Slice Cultivos

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Registro y análisis de la dinámica de conjuntos neuronales multimodales a gran escala en una matriz de microelectrodos de alta densidad integrada en CMOS

Aprende a modelar la epilepsia in vitro utilizando matrices de electrodos múltiples con ensamblados cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas. Este método permite registrar la actividad electrofisiológica y evaluar respuestas a fármacos.

Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal

Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

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