La evaluación de la motilidad de células madre neurales uso de un gel de agarosa al dispositivo basado en microfluídica
11 de febrero de 2008
Nos demuestran que la sobreexpresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mejora la motilidad de las células madre neurales (NSC) utilizando un nuevo gel de agarosa de microfluidos dispositivo basado. Esta tecnología puede ser fácilmente adaptable a otros sistemas de células de mamíferos, donde las fuentes de células son escasos, como las células madre neurales, y la vuelta el tiempo es crítico.
Hola, soy Kevin ganó. Soy estudiante de maestría en ingeniería en el Laboratorio de Biofluidos de la Universidad de Cornell. Y hoy voy a hablar sobre el uso de un dispositivo microfluídico basado en agros para estudiar el efecto del factor de crecimiento epidérmico EGF en las células madre neuro Maureen.
El dispositivo consta básicamente de tres canales microfluídicos, cada uno de 150 micras de ancho. El FEAG se bombea a uno de los canales laterales y el tampón se bombea al otro canal lateral. Básicamente, establece un gradiente químico lineal estático a través del canal central.
Dado que el EGF difuso se difunde fácilmente a través del agrogel, las células madre de las neuronas se siembran en el canal central y el progreso de su migración se monitorea a través de un microscopio. Por lo tanto, los dispositivos se componen básicamente de una capa superior de plexiglás que tiene todas las entradas y salidas para conectarse a la tubería. Y debajo de eso hay una membrana de agro gel, que tiene cuatro dispositivos de patrón.
Este está rodeado por un espaciador PDMS, lo que garantiza que tengamos un grosor constante en todo el dispositivo. El PDMS y el gel se ensamblan en un portaobjetos de vidrio, que está recubierto con ect. Esto ayuda a que las células se adhieran al portaobjetos de vidrio.
Además, la placa de acero inoxidable se utiliza para montar todo el dispositivo y se intercala el dispositivo con tornillos. La línea celular de tipo salvaje se ha transfectado con un vector de retrovirus para sobreexpresar el receptor de EGF de tipo salvaje y la línea celular delta se ha transfectado con una versión mutada del receptor de EGF que le permite ser constitutivamente activa sin el ligando de EGF. Bien, voy a comenzar explicando el proceso de ensamblaje de nuestro dispositivo micro fluídico.
Así que primero coloqué el espaciador PDMS alrededor de las características de relieve de los microcanales de silicio en nuestros maestros. Así que ahora voy a pesar 0,3 gramos de agros. Así que ahora voy a traer 10 milésimas de pulgada de medios independientes de CO2 y añadirlas a los agros.
Y voy a pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar el polvo de aros con los medios independientes de CO2. Ahora estamos listos para el microondas. Como puede ver ahora, el agros ahora está licuado, pero aún quedan algunos gránulos.
Intentaré girar esto para disolver el gránulo y deshacerme de las burbujas de aire. Así que estoy vertiendo los agros fundidos en las características de relieve del maestro de silicona y ahora tomaré un portaobjetos de vidrio estéril y lo colocaré sobre el espaciador PDMS. Y lo puse en ángulo para tratar de forzar la mayoría de las burbujas de aire en el agrogel hacia afuera.
Y apliqué presión y seguiré aplicando presión hasta que la cáscara de agros se solidifique. Entonces, después de uno o dos minutos, se ha solidificado. Ahora voy a quitar el exceso de agros de la diapositiva.
El siguiente paso es deslizar suavemente fuera del portaobjetos de vidrio y este portaobjetos de vidrio se puede montar y desechar. Ahora voy a intentar transferir suavemente el patrón aros a un portaobjetos de vidrio que previamente he recubierto con fibronectina. Básicamente, utilizo esta lámina estéril de plástico para ayudarme a levantar los agros del patrón con el espaciador PDMM MS y transferiré los agros del patrón con los canales hacia el portaobjetos.
Ahora que esto está firmemente en la corredera de vidrio, perforaré agujeros en los depósitos individuales para que el colector de plástico tenga acceso a los canales. Haré esto usando un pequeño perforador de metal. Ahora hemos terminado de perforar agujeros en el dispositivo.
Agregaré 500 microlitros de medios independientes de CO2 para evitar la desecación de los microcanales y ahora lo dejaré reposar durante uno o dos minutos. Bien, después de uno o dos minutos, intentaré drenar el exceso de medios y ahora alinearé los orificios que se perforaron en los agros del patrón con los orificios de entrada y salida del colector de plexiglás. Y una vez que se han alineado los agujeros, presiono firmemente para formar un bonito sello.
Ahora coloco el colector de plexiglás sobre los soportes de acero inoxidable y ahora intercalaré suavemente el dispositivo con tornillos. Tengo mucho cuidado de no apretar demasiado los tornillos porque esto aplastará los canales y coloco los tornillos en el sentido de las agujas del reloj para evitar que el interior se apodere de un patrón de gel Agros. Voy a dibujar una milla de medios y usaré esta jeringa para probar el dispositivo.
Y como puedes ver, estoy inyectando líquido en cada microcanal y buscando que salga líquido de cada salida. Así que ahora mismo he colocado el dispositivo ensamblado en la cámara ambiental del microscopio. Este se mantiene a 37 grados centígrados, por lo que esto calentará el dispositivo y lo dejará listo para cuando necesitemos sembrar las células.
Y como puedes ver, ya he enhebrado los dos, el tubo de la bomba de la sombrilla, a través de la configuración. Y actualmente estoy lavando la tubería con PBS en preparación para nuestros experimentos. Así que ahora vamos a configurar el tubo.
Voy a enhebrar el tubo de la bomba de sombrilla a través de las tapas con agujeros ya perforados. Y cada tubo tiene un número específico de muescas para que pueda identificar tanto la entrada como la salida del tubo. Por lo tanto, el tubo con cuatro muescas recibirá los 10 nanogramos por mil.
La solución EGF ahora conectará el tubo al dispositivo. Así que lo conectaré a cada dispositivo de acuerdo con la cantidad de muescas que tenga. Por lo tanto, corresponde a la solución que está adoptando.
Y ahora conecto el tubo de salida. Utilizamos un tubo de tigón transparente para garantizar que el medio fluya efectivamente a través del tubo de salida y que no haya obstrucciones en el canal. Y ahora voy a empezar con los zapatos de salón de la sombrilla.
Así que ahora comenzaré el procedimiento para sembrar las células en el canal central. Comenzaré por eliminar el exceso de medios en el canal del sensor. Así que ahora voy a ver las células.
Las células ya están en suspensión en medios independientes del CO2. Y yo estaba vendido, estaba sentado a 60 en la entrada del canal central y estaba sentado a 20 microlitros en la salida. Y, con suerte, las células se asentarán por el flujo impulsado por la gravedad.
Y repetiré este procedimiento para los otros dos canales sensibles y ahora observaremos esto bajo el microscopio para ver si el asentamiento de las células fue exitoso. Así que ahora las células se han adherido al portaobjetos de vidrio y en unos minutos comenzarán a extenderse y alcanzar su morfología única. Así que hoy cubrimos el ensamblaje del dispositivo real, la preparación de los reactivos y las técnicas de microscopio que utilizo para obtener imágenes de la migración celular dentro del dispositivo.
En conclusión, esperamos que este dispositivo tenga una abdicación mucho más amplia, concretamente en el ámbito clínico. Así que figura uno horizontalmente. Muestra las trayectorias de las células C 17.2 y el aumento de las concentraciones de EGF verticalmente.
Muestra las trayectorias de las distintas cepas de las células C 17.2 que hemos utilizado en nuestros experimentos con la misma concentración de EGF. Los datos de la célula parental muestran que hay un pico de motilidad en el gradiente de concentración de EGF de 10 nanogramos por mil, lo que indica que los receptores se han saturado con ligando a una concentración de EGF más alta. Y los datos de tipo salvaje muestran que hay un aumento en la motilidad a la concentración de cien nanogramos por mil, o EGF.
Esto indica que los receptores no se saturan a concentraciones más altas de EGF. Esto tiene sentido, ya que han sido diseñados para sobreexpresar el receptor EGF. Por último, los datos de la línea celular delta indican que la motilidad de las células es aproximadamente independiente de la concentración de EGF.
Esto también es esperable, ya que los receptores de EGF mutados fueron diseñados para ser activados independientemente de la presencia de EGF.
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Descripción general
Este estudio demuestra que la sobreexpresión de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) aumenta la motilidad de las células madre neurales (NSCs) mediante un novedoso dispositivo microfluídico basado en gel de agarosa. Esta tecnología es adaptable a otros sistemas de células de mamíferos donde las fuentes celulares son escasas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Microfluídica
Antecedentes
- El factor de crecimiento epidérmico (EGF) influye en el comportamiento celular.
- Las células madre neurales (NSCs) son cruciales para la regeneración neural.
- Los dispositivos microfluídicos permiten un control preciso de los entornos celulares.
- Comprender la motilidad de las NSC puede contribuir a la medicina regenerativa.
Objetivo del estudio
- Investigar el efecto del EGF sobre la motilidad de las CNE.
- Desarrollar un dispositivo microfluídico para estudiar las respuestas celulares.
- Proporcionar información sobre el comportamiento de las CNE en un entorno controlado.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de un dispositivo microfluídico basado en gel de agarosa.
- Creación de un gradiente químico lineal estático de EGF.
- Observación de la motilidad de las CNE en respuesta a la exposición al EGF.
- Uso de canales microfluídicos para un control preciso de los fluidos.
Resultados principales
- La sobreexpresión de EGFR aumenta significativamente la motilidad de las CNE.
- El dispositivo microfluídico crea eficazmente gradientes químicos.
- Los resultados indican aplicaciones potenciales en terapias regenerativas.
- Los hallazgos pueden adaptarse a células madre neurales humanas.
Conclusiones
- El EGF desempeña un papel fundamental en la motilidad de las CNE.
- El dispositivo desarrollado es una herramienta valiosa para estudios celulares.
- La investigación futura puede ampliarse a otros tipos celulares y condiciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La motilidad de las células madre neurales sirve como biomarcador predictivo del potencial tumorigénico y de trastornos del desarrollo, lo que hace esencial su evaluación cuantitativa en la validación temprana de objetivos. La plataforma microfluídica basada en gel de agarosa permite ensayos de motilidad reproducibles y controlados por gradientes, que apoyan la desestimación mecanicista de moduladores de la vía EGFR. Este enfoque aumenta la confianza en la identificación de compuestos líderes al vincular la sobreexpresión de receptores con resultados fenotípicos funcionales en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la motilidad dependiente del EGFR como lectura funcional del acoplamiento al blanco en células madre neurales.
- Valor operativo: Proporciona un microentorno controlado para aislar los efectos de la señalización del EGFR de variables de confusión en ensayos de motilidad.
- Valor predictivo: Facilita la selección fenotípica de moduladores del EGFR mediante la cuantificación de cambios en la motilidad bajo gradientes químicos definidos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera mediciones ópticas cuantitativas de la motilidad que se adaptan al análisis de alto contenido y a la selección de compuestos.
- Reproducibilidad: La fabricación del gel de agarosa garantiza una geometría de canales y propiedades de difusión consistentes entre réplicas.
- Escalabilidad: El diseño de múltiples dispositivos en una sola membrana de gel permite la evaluación paralela de múltiples condiciones o líneas celulares.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Relaciona la motilidad de las CNE con la evaluación de factores tumorigénicos, apoyando modelos preclínicos de invasión de células madre del cáncer cerebral.
- Reducción mecanicista de riesgos: Aclara si la sobreexpresión de EGFR induce motilidad independiente del ligando, orientando la selección de dianas para estrategias inhibitorias.
- Continuidad traslacional: Permite comparar variantes de EGFR de tipo silvestre, sobreexpresadas y activas constitutivamente para predecir perfiles de respuesta clínica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El dispositivo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, proporcionando datos fenotípicos basados en la motilidad que orientan las decisiones de avance o interrupción antes de la inversión preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el papel del EGFR en la motilidad de las CNE mediante un control preciso de gradientes y un análisis en tiempo real.
- Tamización: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados de motilidad que permiten comparar compuestos que modulan el EGFR o variantes genéticas.
- Análisis: Genera métricas basadas en trayectorias que facilitan la comparación estadística de la motilidad entre distintas condiciones y líneas celulares.
- Investigación Traducional: Relaciona los hallazgos de motilidad in vitro con su relevancia fisiopatológica en modelos de desarrollo neural y de cáncer cerebral.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de gel de agarosa es adaptable a otros tipos celulares de mamíferos, favoreciendo la estandarización entre proyectos en ensayos basados en la motilidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la señalización de EGFR al vincular el estado del receptor con fenotipos funcionales de motilidad.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad del ensayo mediante la fabricación estandarizada de geles y la generación de gradientes a través de la perfusión por canal lateral.
- Valor estratégico: Mejora la priorización de objetivos al proporcionar una validación funcional más allá de los ensayos de unión o expresión.
- Impacto en la cartera: Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos dirigidos a EGFR basado en la desvinculación fenotípica guiada por la motilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el ensamblaje de microfluidos, manipulación de geles de agarosa e imagenología de células vivas bajo perfusión controlada.
- Depende del acceso a bombas de perfusión, cámaras ambientales y microscopios invertidos para el seguimiento del movimiento celular mediante imágenes de lapso de tiempo.
- Necesita la estandarización de la densidad de siembra celular y del grosor del gel para garantizar gradientes de difusión y adhesión reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos celulares según sus propiedades de adhesión y características de movilidad sobre superficies recubiertas con fibronectina.
- Está limitado por la accesibilidad óptica de la matriz de gel y por la posible autofluorescencia que afecte ciertas lecturas basadas en fluorescencia.
