Caracterización de espectros de absorción biológica que abarcan desde el visible hasta el infrarrojo de onda corta

Nuestro laboratorio desarrolla herramientas basadas en la luz que proporcionan información diagnóstica para aplicaciones de salud materna. A menudo utilizamos la espectroscopia óptica debido a la gran cantidad de información relacionada con la salud que puede proporcionar de forma no invasiva, como la monitorización de la oxigenación sanguínea y la concentración de hemoglobina, ambos parámetros fisiológicos importantes que hay que vigilar durante el embarazo. Algunos disolventes en el agua particulada tienen una fuerte absorción que puede eclipsar los solutos de interés.

Además, los espectros que abarcan la región VIS-SWIR a menudo tienen grandes diferencias en la absorción en diferentes rangos de longitudes de onda, y tenemos que cambiar la configuración experimental para diferentes regiones para obtener espectros SNL altos. La dificultad en la adquisición de espectros biológicos VIS-SWIR ha contribuido a que los espectros de absorción biológica publicados sean limitados, y nuestro objetivo es simplificar este proceso. Además, una mejor comprensión de las características espectrales específicas de cada componente biológico ayudará a elegir longitudes de onda optimizadas que podrían minimizar el sesgo de pigmentación de la piel causado por una fuerte absorción de melanina.

Esperamos que nuestro protocolo permita a los investigadores ampliar la biblioteca actual de absorbentes biológicos VIS-SWIR. Estos resultados también ponen de manifiesto el impacto de la melanina en los dispositivos ópticos en función de la longitud de onda y pueden utilizarse para diseñar sistemas con un sesgo mínimo de pigmentación de la piel, como en el SWIR. Para preparar la muestra de hemoglobina oxigenada con sangre humana heparinizada completa, pipetee 1,8 mililitros de sangre en un tubo de microcentrífuga.

Centrifugar el tubo a 9,6 g durante 10 minutos y desechar aproximadamente 850 microlitros de sobrenadante sin alterar el pellet. Reconstituya el pellet en aproximadamente 850 microlitros de agua deuterada y vuelva a centrifugar a 9,6 g durante 10 minutos. Después de la última centrifugación, para lisar los glóbulos rojos, reconstituya los gránulos de glóbulos rojos con 4,5 mililitros de agua deuterada.

Si el pellet se adhiere al tubo, enjuague con una porción de agua deuterada para aflojarlo. Con una aguja de punta roma y una jeringa, retire la solución de sangre lisada del tubo. Luego, separe la aguja de punta roma de la jeringa y deséchela en un recipiente para objetos punzocortantes de riesgo biológico.

A continuación, coloque un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros en la jeringa y filtre el contenido en una longitud de recorrido de 10 milímetros, un vaso de 3,5 mililitros o una cubeta de cuarzo. Asegure la cubeta con un tapón hermético para evitar la contaminación. Envuelva Parafilm alrededor del tapón para asegurar un sello completamente hermético.

Prepare una referencia llenando una cubeta limpia con el mismo recorrido, longitud y volumen, con agua deuterada para las mediciones de referencia y de referencia. Para preparar la muestra de hemoglobina desoxigenada, agregue ditionito de sodio a la solución sanguínea en la cubeta. Asegure la cubeta con un tapón hermético y envuelva Parafilm alrededor del tapón para garantizar un sellado hermético.

Incline con cuidado la cubeta de lado a lado hasta que el ditionito de sodio se disuelva por completo. Observe el cambio de color de la solución sanguínea de rojo a un rojo púrpura más oscuro. Para comenzar, encienda la lámpara del espectrómetro y los detectores, permitiendo que el sistema se caliente durante 5 a 20 minutos.

Limpie las cubetas con etanol con una toallita Kimwipe. Para un espectrómetro de doble haz, coloque cubetas llenas de agua deuterada como solución de referencia tanto en la cámara de muestra como en la de referencia. Seleccione el rango de longitud de onda apropiado y el detector en función de la región espectral que se va a medir.

Obtenga mediciones de referencia utilizando los parámetros predeterminados. A continuación, reemplace la cubeta en la cámara de muestra con la cubeta que contiene la hemoglobina oxigenada. Cambie al modo Live para ver la absorbancia de forma continua a medida que se ajustan los parámetros de medición.

Comenzando con los parámetros predeterminados del espectrómetro, ajuste las lecturas por datum y ancho de banda para obtener un espectro de absorción cualitativamente limpio sin saturación. Si la modificación de la potencia de la luz incidente, el ancho de banda, el tiempo de exposición y las lecturas por datum no da como resultado un espectro de relación señal-ruido alto, cambie la concentración de la muestra, colocando la cubeta de referencia en la cámara de muestra o de referencia o en la longitud de la ruta de la muestra y la referencia para obtener un espectro de relación señal-ruido alto. Una vez que los ajustes estén optimizados para la muestra, documente los ajustes para cada espectro adquirido.

Con los ajustes optimizados, vuelva a medir utilizando los mismos ajustes que la solución de referencia en las cámaras de referencia y de muestra para obtener la medición de referencia optimizada. A continuación, reemplace la cubeta de referencia en la cámara de muestras con la cubeta de muestra de hemoglobina oxigenada y tome una medición de muestra optimizada. Guarde las mediciones de referencia y de muestra por separado.

Usando la siguiente ecuación, calcule la absorbancia A tratando la medición de referencia como I0 y la medición de la muestra como I.Para el posprocesamiento, software de análisis de datos abiertos como MATLAB, y cargue las mediciones de absorbancia adquiridas de diferentes regiones del espectro. Aplique un factor de multiplicación a una región espectral para unir diferentes regiones con diferentes concentraciones de muestra o longitudes de trayectoria. El espectro de la hemoglobina oxigenada mostró una fuerte correlación con un espectro publicado por Prahl, con distintos picos de absorción a 415 nanómetros y un doblete entre 540 y 575 nanómetros en la región visible, junto con una amplia característica de absorción entre 800 y 1.100 nanómetros en el infrarrojo cercano.

En la región infrarroja de onda corta. El espectro de hemoglobina oxigenada mostró baja absorción, probablemente debido al contenido de agua residual. El espectro de hemoglobina desoxigenada mostró una fuerte correlación con el espectro de Prahl, con picos prominentes de 430 nanómetros, 560 nanómetros y 760 nanómetros, y picos más pequeños alrededor de 1.200 nanómetros y entre 1.400 y 1.600 nanómetros.