Name: La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende el método de glicoproteómica guiada por glucómica para estudiar el glicoproteoma en microambientes tumorales complejos. Esta técnica integrada permite obtener información precisa sobre glicoproteínas humanas mediante espectrometría de masas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Perfil de tejidos de cáncer colorrectal mediante glicoproteómica guiada por glicómica

La glicosilación de proteínas es un tipo frecuente y complejo de modificación traslacional y postraduccional de proteínas producidas por especies a lo largo del árbol filogenético de la vida 1,2,3. Se sabe que los glicanos ligados a proteínas influyen en una amplia gama de procesos biológicos importantes para la salud humana, incluida la mediación y regulación de las interacciones celulares y los eventos de comunicación 4,5. Se ha pensado que la glicosilación aberrante de proteínas es una causa de transformación maligna, progresión tumoral y diseminación 6,7,8. Esto implica a los glicanos en procesos tumorales clave en el microambiente tumoral (TME) y ofrece un potencial considerable y en gran parte sin explotar para el descubrimiento de biomarcadores basados en glicanos y aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, la glicobiología está recibiendo cada vez más atención en la investigación del cáncer y en las ciencias de la vida9.
Impulsados por los desarrollos clave en glicoanalítica e informática durante la última década 10,11,12,13,14,15,16,17, la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) impulsada por glucómica y glicoproteómica se han establecido como herramientas poderosas para el perfil de todo el sistema de glicanos liberados y glicopéptidos intactos a partir de mezclas complejas de glicoproteínas extraídas directamente de los orígenes de sus muestras biológicas, como varios tipos de muestras de pacientes con cáncer (por ejemplo, tejidos tumorales, poblaciones de células, fluidos corporales)3,13,18,19,20.
La glicomica proporciona información sobre la estructura y la cantidad del repertorio de glicanos (el glicome), que es producido dinámicamente por células, tejidos e incluso organismos completos. Por otro lado, la glicoproteómica proporciona información cuantitativa sobre los transportadores de proteínas y su(s) sitio(s) de glicosilación, las tasas de ocupación del sitio (macroheterogeneidad), las composiciones de glicanos específicas del sitio y su patrón de distribución del sitio (microheterogeneidad) con información estructural de glicanos limitada (a menudo limitada a la composición de glicanos)15,16,21. Por lo tanto, la glucómica y la glicoproteómica son enfoques complementarios para estudiar los detalles bioquímicos del glicoproteoma22.
Se han desarrollado y aplicado en todos los laboratorios una miríada de diseños metodológicos y estrategias analíticas para la glucómica y la glicoproteómica en función del glicoanalito de interés (por ejemplo, ligado a N-/O-/C, glicano/glicopéptido/glicoproteína, marcado/no marcado), la naturaleza de la muestra (p. ej., células, tejidos, fluidos corporales), la cantidad (niveles de proteínas de nanogramos/microgramos/miligramos) y el instrumento analítico disponible23. 24,25,26,27,28,29,30,31,32. A pesar de los beneficios reconocidos de su uso paralelo, la glicómica y la glicoproteómica no se aplican comúnmente juntas, sino más bien como enfoques independientes en los estudios de investigación glicobiológica y oncológica debido a su alta demanda de experiencia analítica e instrumentación especializada.
Reconociendo esta brecha tecnológica, hace más de una década, introdujimos el método de glicoproteómica asistida por glucómica, que es capaz de integrar datos glucómicos y glicoproteómicos obtenidos de especímenes biológicos complejos33. En resumen, la tecnología de glicoproteómica asistida por glucómica (o guiada por glucómica como en este protocolo) perfila los N- y/o O-glicanos a través de un método LC-MS/MS de carbono grafitizado poroso (PGC)establecido34,35, que luego se utilizan para el análisis de datos de Nglicopéptidos y/o O-glicopéptidos intactos adquiridos de la(s) misma(s) muestra(s) definiendo los límites del espacio de búsqueda de glicanos36. PGC-LC-MS/MS es un método glucómico particularmente poderoso, ya que proporciona información cuantitativa sobre el glicoma con alta sensibilidad y resolución estructural, proporcionando información sobre la topología (secuencia de monosacáridos y patrón de ramificación) y los enlaces glucosídicos de los glicanos incluso dentro de mezclas complejas 35,37,38. El flujo de trabajo de glicoproteómica implica la generación de péptidos, el etiquetado opcional de péptidos, la multiplexación y el prefraccionamiento, así como el enriquecimiento antes del análisis LC-MS/MS de fase reversa que idealmente emplea diferentes métodos de fragmentación, incluida la energía de colisión escalonada/disociación colisional de mayor energía (sceHCD, para N-glicopéptidos) y la transferencia de electrones/disociación colisional de mayor energía (EThcD, para O-glicopéptidos) para la identificación de analitos. Para el análisis de N-glicoproteoma, la de-N-glicoproteómica paralela puede guiar el análisis de datos de N-glicopéptidos intactos definiendo el espacio de búsqueda proteína/péptido y proporcionando más detalles sobre los sitios de N-glicosilación ocupados y su tasa de ocupación del sitio, mientras que el análisis paralelo de péptidos no modificados revela cualquier cambio en el nivel de proteína entre las condiciones estudiadas.
Este documento proporciona un protocolo paso a paso detallado y fácil de seguir para el método de glicoproteómica guiado por glucomicas (consulte la Figura 1 para obtener una descripción general del flujo de trabajo). El protocolo proporciona detalles experimentales de los pasos de preparación de la muestra y los experimentos de glicomica y glicoproteómica basados en LC-MS/MS, y presenta resultados representativos que demuestran la aplicación del método a secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) de tumores resecados de pacientes con cáncer colorrectal (CCR), lo que permite comprender la glicobiología del TME en un valioso tipo de muestra que se archiva en biobancos de cáncer de todo el mundo. También se discute brevemente el análisis y la integración de datos glucómicos y glicoproteómicos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del método de glicoproteómica guiado por glucomica. La descripción general muestra los pasos experimentales detallados en los flujos de trabajo de glucómica (izquierda) y glicoproteómica (derecha), con una descripción general de la información obtenida (en negrita) y cómo se integran los dos enfoques a través de un mejor análisis e interpretación de datos. Inserto: Microcolumnas de SPE de fabricación casera utilizadas para los flujos de trabajo de (i) glucómica y (ii-iii) glicoproteómica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><fuerte>químicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de amonio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio, pureza &ge; 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Acetonitrilo anhidro (ACN), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Fetuin bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Ácido fórmico, grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Yodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGasa F (10 U/&mu; L) expresado recombinantemente en Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>484016 Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Tripsina porcina de grado secuencial&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Bicarbonato de trietilamonio (TEAB), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA), grado LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Tools/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18</td><td>discos Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>C8</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno de 96 pocillos de fondo plano&nbsp;</td><td>Membrana de</td> difluoruro de polivinilideno (PVDF) Corning <td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ</td><td>Millipore IPVH20200</td><td></td><td>Tamaño de poro: 0,45 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Alternativas disponibles Adaptadores</td></tr><tr><td>de microcentrífugas&nbsp;</td>El <td>collar de columna MiniSpin</td>de <td>Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td>, viene con columnas Microspin</tr><tr><td>Oligo R3 resina</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>tamaño de partícula 30 &mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Protein LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Protein LoBind 2,0 mL</td><td>Tubos Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock 1,5</td><td>mL Tubos Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock 2,0</td><td>mL Eppendorf Agitador 0030120094</td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td></td><td></td><td>5382000066</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Perforadora de un solo agujero</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>Concentradora SpeedVac</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Resina Supelclean ENVI-Carb SPE</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Tamaño de partícula 120-400 malla. La resina se puede extraer manualmente de los cartuchos y se puede almacenar a largo plazo en metanol al 50% (v/v) en agua MilliQ</td></tr><tr><td>Jeringa Sigma Aldrich Z116866 5 mL</td><td></td><td></td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura controlada</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Resina ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Tamaño de partícula/poro, 5 &mu; m/200 &Aring;. La resina se puede extraer manualmente de la columna LC y se puede almacenar a largo plazo en metanol al 50% (v/v) en</td></tr><tr><td>microcolumnas de extracción en fase sólida (SPE) ZipTip C18 de agua MilliQ&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternativamente, las microcolumnas C18-SPE de fabricación casera pueden reemplazar el sistema de</td></tr> HPLC capilar Infinity <tr><td>LC-MS/MS de producto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Capillary Analysis&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Columna analítica LC preempaquetada con resina ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemania</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Tamaño de partícula/poro: 3 &mu; m/120 &Aring;, longitud/diámetro interior: 25 cm/75 &mu;m. También están disponibles columnas comerciales C18 nano-LC/&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp;</td><td>Alternativas térmicas</td><td></td><td>disponibles</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGC capilar LC columna&nbsp;</td><td>Tamaño de</td> partícula/poro <td>termodescontinuado</td><td>, 3 &mu; m/250 &Aring;; longitud de la columna, 30 mm; diámetro interior, 0,180 mm. Las geometrías más grandes de las columnas HyperCarb PGC-LC, que producen datos de calidad similares, están disponibles comercialmente (por ejemplo, Thermo #35003-031030). Columna SupelTMCarb LC de Merck con un tamaño de partícula/poro, 2,7 &mu; m/200 y con diferentes longitudes de columna y diámetro interno también están disponibles (por ejemplo, Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetonitrilo de grado LCMS</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Trampa lineal cuadrupolar (LTQ) Espectrómetro de masas de trampa de iones Velos Pro (glicómica)&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>Alternativas disponibles</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas tricríbrido Orbitrap Fusion Lumos (glicoproteómica)</td><td>Thermo</td><td></td><td>También están disponibles otros sistemas MS de alta resolución con o sin ETD (solo necesarios para O-glicoproteómica) (por ejemplo, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker o espectrómetros de masas de alto rendimiento similares de otros proveedores)</td></tr><tr><td>Viales de tornillo de vidrio transparente de recuperación total de 0,9 ml</td><td>Alternativas Thermo</td><td>THC11093563</td><td>disponibles</td></tr><tr><td>Viales de rosca de vidrio transparente de recuperación total tapas a juego</td><td>Alternativas Thermo</td><td>THC09150869</td><td>disponibles</td></tr><tr><td>Columna Trap LC empaquetada internamente con resina ReproSil-Pur C18 AQ&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemania</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Tamaño de partícula/poro: 5 &mu; m/120 &Aring;, longitud/diámetro interior: 2 cm/100 &mu;m. También están disponibles columnas comerciales C18 trap LC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 o superior</td><td>Motor de búsqueda comercial de glicopéptidos y PTM, que acepta datos brutos de LC-MS/MS de la mayoría de los proveedores de MS</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 o superior</td><td>Software comercial para la inspección manual de candidatos a glicopéptidos y la anotación automática de espectros de glicanos MS/MS</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Software de acceso abierto Expasy</td><td></td><td>, que ayuda a la anotación de datos glicómicos (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Software de acceso abierto, que ayuda a la anotación de datos glucómicos y al dibujo de dibujos animados de glicanos</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Software de acceso abierto, que extrae m/z de iones precursores de glicanos a partir de datos espectrales brutos</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 o superior</td><td>Software de acceso abierto para la cuantificación relativa de glicanos</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 o superior</td><td>Para navegar por datos LC-MS/MS sin procesar</td></tr></tbody></table>

la glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

En esta sección se proporcionan resultados representativos del método de glicoproteómica guiado por glucómica aplicado a un portaobjetos de tejido FFPE de un paciente con CCR en estadio II.
Para lograr suficiente material de partida proteico para el protocolo, se combinaron extractos de proteínas de dos portaobjetos (pilas z) del mismo bloque de tejido FFPE siguiendo un protocolo publicado y se aplicó un enfoque de etiquetado TMT para aumentar la sensibilidad del experimento de glicoproteómica...

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

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Investigación

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Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

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