Name: Ensayo cuantitativo basado en PCR para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo cuantitativo basado en PCR para evaluar la señalización Sonic Hedgehog en células RPE-1. Este método permite examinar alteraciones genéticas y epigenéticas asociadas con la disfunción de cilios primarios.

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<ol><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
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<li>Niewiadomski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli+protein+activity+is+controlled+by+multisite+phosphorylation+in+vertebrate+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling.</a> Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).</li>
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<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hedgehog-dependent+full-length+gli3+accumulation+in+primary+cilia+and+subsequent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation.</a> Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).</li>
<li>Griffiths, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-interacting+protein+is+a+multimodal+antagonist+of+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling.</a> Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).</li>
<li>Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+cilia+characteristics+and+hedgehog+signaling+in+five+immortal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines.</a> PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+shh+signaling+impairments+in+human+and+mouse+models+of+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease.</a> Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+primary+cilia+number+and+length+upon+vdac1+depletion+contributes+to+attenuated+proliferation+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells.</a> Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).</li>
<li>De, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+cdh1+in+glioblastoma+cancer+stem+cells+attenuates+apc%2Fc%28cdh1%29+activity+and+pharmacologic+inhibition+of+apc%2Fc%28cdh1%2Fcdc20%29+compromises+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability.</a> Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).</li>
<li>Yang, S., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunofluorescence-based+detection+of+hedgehog+pathway+components+in+primary+cilia+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mir-669a-5p%2Fg3bp%2Fhdac6%2Fakap12+axis+regulates+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).</li>
<li>Alanazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+roles+of+mir-17+in+ciliogenesis+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miqe+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+pcr+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMSO, filtrado estéril</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Burro, anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Burro, anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de</td> <td>DulbeccoGibco, ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Microscopio de</td> fluorescencia <td>Himedia RM1112</td><td></td></tr><tr><td>equipado con objetivo 60X</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td>Axio observador colibri 5</td></tr><tr><td>células hTERT-RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad Laboratories 1708891</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ratón, anticuerpo monoclonal anti-tubulina acetilada</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Dilución final 1:1000</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 100X</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR cuantitativa, CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conejo, anticuerpo policlonal Arl13B</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>Dilución final 1:250</td></tr><tr><td>Conejo, anticuerpo policlonal Cep135</td><td>ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>Dilución final 1:500</td></tr><tr><td>SlowFade gold Antifade moutant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>Suavizado Agonista (SAG)&nbsp;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>Solución madre: en DMSO, 5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo cuantitativo basado en pcr para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis

Quantitative PCR-based Assay to Measure Sonic Hedgehog Signaling in Cellular Model of Ciliogenesis

La activación de la vía de transducción de señales SHH mediada por PC es una forma de comprender el correcto funcionamiento de PC7. Aquí, la expresión relativa de los genes diana de la vía SHH se mide mediante el ensayo RT-qPCR tras la activación mediada por SAG de la vía SHH en células RPE1 que en su mayoría están ciliadas. Las salidas transcripcionales directas de la vía SHH GLI1 y PTCH1 se emplean con frecuencia para medir la actividad de esta vía11. Este protocolo tambi...

Ensayo cuantitativo basado en PCR para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis

Ciliopathy refers to a collection of multisystemic and polygenic human diseases and disorders that arise due to aberration of structure or function of ...

quantitative-pcr-based-assay-to-measure-sonic-hedgehog-signaling

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Investigación

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Biología

Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.

Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

El manuscrito que aquí ofrece un simple conjunto de métodos para el análisis de la secreción y la difusión de ligandos marcados con fluorescencia en Xenopus. Esto proporciona un contexto para probar la capacidad de otras proteínas para modificar la distribución de ligando y permitir que los experimentos que pueden dar información sobre los mecanismos que regulan los gradientes de morfogenes.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

Los cilios primarios influyen en varias vías de señalización. La cóclea de mamíferos es ideal para examinar la señalización de la polaridad de las células planas (PCP). La disfunción de los cilios afecta el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, lecturas de PCP. Nuestro objetivo es analizar la señalización de PCP en la cóclea de ratón mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido.

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

Se proporciona un protocolo para el cultivo y manipulación de tejido embrionario de ratón en un chip microfluídico. Mediante la aplicación de pulsos de moduladores de vía, este sistema se puede utilizar para controlar externamente las oscilaciones de señalización para la investigación funcional de la somitogénesis del ratón.

Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Respuesta trompa de extensión o PER es un ensayo de comportamiento de sabor que se ha utilizado en las moscas, así como en las abejas. Cuando la trompa se pone en contacto con una sustancia atractiva, la mosca se extiende su trompa para consumir la sustancia. Soluciones de diversos azúcares son muy atractivos para la marcha.

Extensión probóscide Respuesta (PER) Ensayo en Drosophila

Aprende a desarrollar un ensayo cuantitativo basado en PCR para evaluar la señalización Sonic Hedgehog en células RPE-1. Este método permite examinar alteraciones genéticas y epigenéticas asociadas con la disfunción de cilios primarios.

Ensayo cuantitativo basado en PCR para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis

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