Name: Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio unicelular con el indicador Fura-2/AM para estudiar la activación de canales iónicos de calcio en células vivas. Este método permite monitorear cambios de calcio en tiempo real en múltiples células simultáneamente.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes de calcio de una sola célula para estudios de activación de canales

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Bharate, S. S., Bharate, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+thermoreceptor+trpm8+by+cooling+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds.</a> ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).</li>
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<li>Behera, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+dynamics+using+a+ubiquitin-10+promoter-driven+yellow+cameleon+3.6+indicator+reveal+reliable+transgene+expression+and+differences+in+cytoplasmic+Ca2%2B+responses+in+arabidopsis+and+rice+%28oryza+sativa%29+roots%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots.</a> New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cámara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma 211275</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CL-100 controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido ciclopiazónico (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 luz</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Software de imágenes de fluorescencia (MetaFluor, software de pago)&nbsp;</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>moleculares Microscopio de fluorescencia</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lisina</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 dispositivo de calefacción / enfriamiento de circulación de líquidos&nbsp;</td><td>Aparato de Harvard Fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de luz blanca</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Detección de respuesta a la temperatura 
Queratinocitos primarios Los queratinocitos primarios se aislaron de ratones recién nacidos y se prepararon de acuerdo con los protocolos establecidos10. Estas células se sembraron en placas de 24 pocillos que contenían portaobjetos de vidrio. Después de la carga de la sonda Fura-2, el enfoque se ajustó bajo el microscopio a una longitud de onda de 380 nm para lograr una visualización clara de la morfología celular, como se ilustra en la Figura 2A. Si la sonda no se cargó correctamente durante el proceso, las celdas no serían visibles. El tampón extracelular en la cámara se reemplazó continuamente a través de un sistema de perfusión, asegurando condiciones óptimas para las células. El sistema de control de temperatura se conectó al sistema de perfusión, lo que permitió la detección de respuestas térmicas celulares mediante el control de los cambios de temperatura en el tampón extracelular. Este proceso consistió en calentar gradualmente el tampón extracelular y luego enfriarlo gradualmente.
Se utilizó el sistema de imágenes de Ca2+ de una sola célula para monitorear los cambios en la concentración intracelular de Ca2+ en diversas condiciones experimentales. Como se muestra en la Figura 2B, los queratinocitos mostraron una respuesta térmica distinta cuando se sometieron al calentamiento, así como una respuesta notable durante la fase de enfriamiento. Cabe destacar que esta respuesta a la temperatura desapareció cuando se eliminó el gen STIM1, que es el principal responsable de esta respuesta (Figura 2C)10. Las imágenes de Ca2+ de una sola célula permiten la observación de cambios en tiempo real en la concentración intracelular de Ca2+ en respuesta a diversos estímulos externos, lo que permite un análisis detallado del comportamiento y la señalización celular.
HEK293T células que sobreexpresan los plásmidos diana HEK293T células se sembraron en una placa de 24 pocillos que contenía portaobjetos de vidrio de acuerdo con el método experimental. A continuación, las células se sobreexpresaron con STIM1/Orai1 y su respuesta térmica mediada se detectó utilizando el mismo método descrito anteriormente para las células primarias. En el caso de las células que sobreexpresaban el plásmido objetivo, el éxito de la transfección se confirmó seleccionando las células que expresaban el plásmido correspondiente, según lo indicado por las proteínas fluorescentes rojas o verdes transportadas por el plásmido en longitudes de onda TRITC o FITC. Para este experimento, se utilizaron plásmidos STIM1-GFP/Orai1-DsRed, con GFP detectado bajo FITC, emitiendo fluorescencia verde, y DsRed detectado bajo TRITC, emitiendo fluorescencia roja. Las células que sobreexpresan mCherry vacía (TRITC) se utilizaron como controles negativos. Como se muestra en la Figura 3A, las células fluorescentes observadas bajo FITC indicaron una expresión exitosa de STIM1, lo que permite la selección y el registro de su respuesta térmica durante los procesos de calentamiento y enfriamiento. Las células que no fueron transfectadas sirvieron como control negativo. La Figura 3B demuestra que STIM1/Orai1 exhibió una respuesta térmica significativa durante el proceso de enfriamiento, en contraste con el control negativo que se muestra en la Figura 3C.
Detección de la respuesta a fármacos La tecnología de imágenes de Ca2+ de una sola célula también se puede utilizar para detectar las respuestas celulares a los compuestos. La preparación de la celda para la detección de la respuesta térmica es la misma que la descrita anteriormente. La diferencia entre la respuesta farmacológica y la respuesta térmica radica en que la respuesta térmica suele requerir la activación de las células cambiando la temperatura del tampón extracelular a través de un sistema de perfusión, mientras que los compuestos pueden administrarse bien por perfusión o bien añadiéndolos directamente mediante una pipeta. La adición directa con una pipeta puede conservar eficazmente la cantidad de compuesto utilizado; Sin embargo, la curva resultante no siempre puede ser tan atractiva visualmente como la obtenida a través de la perfusión.
Tomando la Figura 4 como ejemplo, la Figura 4A muestra la respuesta de entrada de calcio operada por almacén (SOCE) de STIM1/Orai1, donde la concentración extracelular de Ca2+ y el contenido de ácido ciclopiazónico (CPA) se cambian secuencialmente a través de un sistema de perfusión para inducir SOCE. En la Figura 4B, el agonista de TRPV1 capsaicina se añade directamente mediante una pipeta a las células que sobreexpresan el plásmido TRPV1. La capsaicina puede activar TRPV1 e inducir la afluencia extracelular de Ca2+.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
Figura 1: Diagrama esquemático de Fura-2 AM. Fura-2 es una sonda de fluorescencia de Ca2+ comúnmente utilizada en biología celular que se une selectivamente a Ca2+ en una proporción de 1:1 y emite fluorescencia. Debido a su naturaleza altamente polar como compuesto ácido, Fura-2 no puede entrar en las células. Para mejorar la permeabilidad celular, se conjuga con acetoximetilo (AM) en su grupo negativo para formar Fura-2/AM. Esta modificación aumenta su solubilidad en éster y elimina la carga negativa. Dentro de las células, Fura-2/AM es hidrolizado por las esterasas en Fura-2, que puede unirse reversiblemente con el Ca2+ citoplasmático libre. Al unirse, la longitud de onda de excitación máxima cambia de 380 nm a 340 nm (cuando está saturada con Ca2+). La intensidad de fluorescencia emitida está cuantitativamente relacionada con la concentración de Ca2+ unido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
Figura 2: Detección de respuesta a la temperatura de queratinocitos primarios. (A) Tinción de Fura-2 de queratinocitos de ratones recién nacidos, observada bajo una lente de objetivo de 20x. (B,C) Respuesta a la temperatura de los queratinocitos WT (B) y los queratinocitos knockout STIM1 (C) mediante un sistema de imagen Ca2+ unicelular. Ampliación: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
Figura 3: Detección de respuesta a la temperatura de STIM1-GFP/Orai1-Dsred sobreexpresada en células HEK293T. (A) Una figura representativa que muestre células positivas que expresan STIM1-GFP según FITC. (B,C) Respuesta a la temperatura de las células HEK293T que expresan el plásmido respectivo detectado por un sistema de imágenes Ca2+ de una sola célula. Ampliación: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
Figura 4: Detección de la respuesta a fármacos mediante imágenes de Ca2+ de una sola célula. (A) Respuesta SOCE de las células HEK293T que sobreexpresan STIM1/Orai1. El tampón extracelular se cambia de Ca2+ a Ca2+ libre mediante un sistema de perfusión. En ausencia de Ca2+, se añade CPA para agotar el Ca2+ del retículo endoplásmico. A continuación, el tampón extracelular se sustituye por un tampón que contiene Ca2+ para inducir la afluencia extracelular de Ca2+ , lo que representa la entrada de Ca2+ operada por la tienda. Las imágenes de Ca2+ de una sola célula se utilizan para registrar dinámicamente los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ inducidos por estos procesos. (B) células HEK293T que sobreexpresan TRPV1-mRuby, donde mRuby es una proteína fluorescente utilizada para comprobar la condición de transfección de la proteína TRPV1. La capsaicina se añade mediante una pipeta, mientras que la afluencia de Ca2+ se registra mediante imágenes de Ca2+ de una sola célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

single-cell-calcium-imaging-for-studying-activation-calcium-ion

Research

Investigación

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La actividad espontánea de la creación de redes neuronales se puede medir con AM-éster formas de tintes indicadores sensibles de calcio. Cambios en el calcio intracelular, lo que indica la activación neuronal, se detectan los cambios transitorios de la fluorescencia con un indicador o imagen de dos fotones. Este protocolo puede ser adaptado para una serie de redes neuronales del desarrollo que dependen...

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Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

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En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Aquí, proporcionamos un protocolo integral para resolver las señales locales iniciales de Ca2+ , conocidas como microdominios de Ca2+ , en células T primarias murinas y humanas mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo sirve como un recurso valioso para los investigadores que examinan las vías de señalización de Ca2+ dentro de las células inmunitarias y para desentrañar aún más su función.

Obtención de imágenes de microdominios Ca2+ iniciales en células T primarias

Aprende a realizar imágenes de calcio unicelular con el indicador Fura-2/AM para estudiar la activación de canales iónicos de calcio en células vivas. Este método permite monitorear cambios de calcio en tiempo real en múltiples células simultáneamente.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

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