Name: Uso de pinzas ópticas para la generación de esferoides híbridos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a construir esferoides híbridos de linfoma usando pinzas ópticas con control preciso en etapas tempranas. Este método no invasivo mejora la estabilización y recuperación para estudios de interacciones celulares tridimensionales.

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1. Fabricación de micromoldes a base de gel de agarosa
NOTA: Las técnicas asépticas adecuadas son esenciales cuando se manipulan todos los cultivos celulares. Todos los reactivos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Prepare tres geles con MSC para un solo experimento como se muestra en la Figura 1A.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparación de esferoides de células estromales mesenquimales (MSC). (A) Ilustración que representa el paso para preparar los micromoldes de agarosa. (B) Siembra de células estromales mesenquimales (MSCs) y cultivo de esferoides mesenquimales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol>
	<li>Comienza preparando los micromoldes de agarosa. Enjuague la placa de Petri 3D del micromolde (consulte la Tabla de materiales) con agua desionizada (3x) y colóquela debajo de la lámpara UV durante 30 minutos para realizar la esterilización.</li>
	<li>Primero, prepare la solución de agarosa al 2%. Mida 1 g de polvo de agarosa puro estéril de alta calidad (consulte la tabla de materiales) y colóquelo en un tubo cónico estéril de 50 ml. Añadir 50 mL de solución estéril de cloruro sódico al 0,9% (ver Tabla de Materiales) a la agarosa y mezclar bien. Atornille la tapa del tubo cónico hasta que esté seguro pero aún suelto.</li>
	<li>Use el horno de microondas para hervir y disolver completamente el polvo de agarosa. Deje de calentar en el microondas cada 10 segundos y agite con cuidado el tubo cónico para asegurarse de que la agarosa se disuelva. Evite crear burbujas al mezclar o pipetear la agarosa. Enfriar la agarosa hasta aproximadamente 70 °C. NOTA: Asegúrese de que no haya restos de polvo translúcido sin disolver. PRECAUCIÓN: La agarosa fundida es extremadamente caliente y puede causar quemaduras graves en la piel.</li>
	<li>Trabajo en cabina de flujo laminar mediante técnicas asépticas. Preparar hidrogeles llenando micromoldes previamente esterilizados con 500 μL de agarosa. Aspire las burbujas que puedan quedar atrapadas en las pequeñas características del micromolde con una pipeta.</li>
	<li>Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, cuando la agarosa se haya solidificado, retire con cuidado los geles de los micromoldes y colóquelos en una placa estéril de 6 pocillos. No dañe la estructura del gel. Antes de continuar con el siguiente paso, verifique bajo un microscopio si los micromoldes se han preparado correctamente y asegúrese de que los bordes estén intactos. Compruebe si hay huecos a través de los cuales pueda filtrarse el medio.</li>
	<li>Agregue suficiente solución salina tampón de fosfato (PBS) para cubrir completamente los micromoldes antes de colocar la placa debajo de una lámpara UV durante 30 minutos para la esterilización. NOTA: Los micromoldes de agarosa pueden almacenarse antes de su uso hasta 2 semanas en un tubo cónico cubierto con 1x PBS en condiciones de refrigerador (4 °C).</li>
	<li>Antes de utilizar los micromoldes para producir esferoides, equilibre el gel cubriéndolo completamente con medio RPMI (4,0 mL/pocillo para una placa de 6 pocillos) e incube durante un mínimo de 15 min.</li>
</ol>
2. Preparación de esferoides de células estromales mesenquimales (MSC)
<ol>
	<li>Cultivo de la línea celular HS-5 (ver Tabla de Materiales), una línea celular del estroma mesenquimal humano, en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y un 1% de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de Materiales) en condición estándar, asegurando un cambio de medio cada 48 h.</li>
	<li>Cuando las células HS-5 sean aproximadamente 90% confluentes, realice el paso de células de la siguiente manera:<ol>
		<li>Retire el medio de cultivo con una pipeta serológica.</li>
		<li>Lave las celdas agregando 1x PBS y agitando y aspirando para eliminar cualquier medio restante.</li>
		<li>Separe las células del fondo del matraz de cultivo añadiendo 2 mL de solución de tripsina-EDTA (véase la tabla de materiales) al matraz de cultivo celular e incubando a 37 °C para facilitar el desprendimiento de las células.</li>
		<li>Detenga la tripsinización añadiendo 2 mL de medio de cultivo completo.</li>
		<li>Con una pipeta de 5 mL, suspenda suavemente las células y transfiérelas a un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 7 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de medio de cultivo fresco.</li>
		<li>Tome 10 μL del pellet de celda y transfiéralo a un tubo de 0,5 mL. A continuación, añada 10 μL de solución de azul de tripano al 0,4% (véase la Tabla de Materiales) y cuente las células en un contador automático de células (véase la Tabla de Materiales).</li>
		<li>En función de la densidad celular obtenida anteriormente, diluya las células hasta 2 x 105 células/mL de medio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular del micromolde de agarosa.</li>
	<li>Siembre con cuidado 190 μL de la suspensión celular mencionada anteriormente (paso 2.2.8) en la cámara de siembra celular del micromolde de agarosa. Un solo pocillo contendrá aproximadamente 150 celdas (38.000 celdas/gel).</li>
	<li>Incubar las células en micromolde de agarosa en una incubadora (5% CO2, 37 °C, atmósfera húmeda) durante 30 min hasta que las células se asienten en el fondo del gel. Después de 30 minutos, retire la placa que contiene el micromolde de la incubadora y agregue lentamente un medio adicional al exterior de los geles, cubriéndolos por completo (p. ej., 4.0 mL/pocillo para la placa de 6 pocillos). NOTA: No agregue el medio directamente sobre el micromolde de agarosa en gel, sino en la placa de cultivo, evitando dañar los esferoides recién formados.</li>
	<li>Coloque el gel en una incubadora a 37 °C en una atmósfera húmeda de 5% de CO2 durante 72 h hasta que se formen esferoides uniformes. (Figura 1B). NOTA: Se recomienda observar la formación de esferoides durante los siguientes 3 días bajo un microscopio invertido. En general, las células estromales mesenquimales comienzan a formar esferoides dentro de las 24 horas, pero este proceso puede ser más rápido o más lento con diferentes conductos y densidades celulares. Después de 72 h de incubación en micromoho de agarosa, las células estromales mesenquimales forman esferoides relativamente uniformes; Sin embargo, vale la pena señalar que pueden variar en tamaño y forma a pesar de estar incubados en condiciones idénticas. El medio necesita ser reemplazado cuando cambia de un color rojo púrpura a amarillo.</li>
</ol>
3. Cultivo de células de linfoma y preparación para el atrapamiento óptico
NOTA: Las líneas celulares hematológicas, incluidas las células de linfoma, crecen flotando libremente en los medios de cultivo en frascos diseñados para el cultivo en suspensión sin ninguna fijación a la placa o recipiente de cultivo. Para mantener las propiedades óptimas de la celda, se recomienda comenzar a preparar la muestra no antes de 30 minutos antes del procedimiento de ensamblaje de los esferoides híbridos con las pinzas ópticas. Es importante destacar que el protocolo descrito en esta sección es para la línea celular de linfoma humano Ri-1, pero se aplica un protocolo similar a otras líneas celulares de cáncer hematológico.
<ol>
	<li>Cultivo de la línea celular de linfoma Ri-1 (ver Tabla de Materiales) en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Mantenga las células de linfoma en la incubadora en condiciones de cultivo estándar, incluyendo 37 °C y aire humidificado con 5% de CO2. Mantener cultivos entre 3-5 x 105 células/mL en la fase logarítmica mediante pases cada 2-3 días.</li>
	<li>Recoja las células y transfiera la suspensión a un tubo de poliestireno de 15 ml. Centrifugar las celdas a 300 x g durante 7 min a temperatura ambiente para obtener un pellet de celda. Retirar el sobrenadante y añadir 10 mL de medio fresco, pipetear suavemente hasta obtener una suspensión homogénea.</li>
	<li>Aspire 10 μL de suspensión celular en un nuevo tubo de centrífuga y agregue 10 μL de azul de tripán. Pipetear bien la suspensión antes de transferir 10 μL a la cámara de recuento para determinar la densidad celular y la viabilidad (normalmente superior al 95%).</li>
	<li>Diluir la suspensión celular para alcanzar una densidad final de 1 x 104 células/mL. Mantenga las células del linfoma a 37 °C hasta las manipulaciones ópticas.</li>
</ol>
4. Configuración del sistema de pinzas ópticas
NOTA: El protocolo a continuación se desarrolló específicamente para las pinzas ópticaspersonalizadas 36 (Figura 2A). Sin embargo, este ensayo se puede utilizar con otros sistemas de trampeo disponibles en el mercado. Independientemente del tipo de equipo disponible, los pasos básicos para la preparación del sistema (por ejemplo, poner en marcha el láser y el software informático, montar la muestra y probar la posibilidad de mover la célula en una trampa óptica) siguen siendo los mismos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, es decir, 25 °C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig02.jpg"> 
Figura 2: Un esquema que ilustra el mecanismo de funcionamiento de la generación de esferoides híbridos mediante pinzas ópticas. (A) Configuración de pinzas ópticas diseñadas a medida. (B) El proceso de unión de células individuales de linfoma a la superficie del esferoide de MSC. Una sola célula de linfoma fue atrapada ópticamente y adherida a la superficie de un esferoide estromal hasta que se formó una conexión estable. Este proceso continuó hasta que toda la superficie del esferoide estromal quedó cubierta por células de linfoma. (C) Se obtuvo una imagen representativa de la tinción inmunohistoquímica de la sección de esferoide híbrido utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD20 contra CD20. La inmunotinción se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón antihumano contra CD20 en un autostainer (ver Tabla de Materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol>
	<li>Encienda la fuente de luz del microscopio.</li>
	<li>Use un vidrio protector seguro para láser.</li>
	<li>Encienda el láser y ajuste la potencia para obtener una rigidez de la trampa de aproximadamente 50 pN/μm en el sistema de pinzas ópticas. Antes de continuar, espere 10 minutos, permitiendo que el rayo láser se estabilice. NOTA: En el sistema hecho a medida, la rigidez de la trampa dada se logra para la potencia del láser de 100 mW en la entrada del objetivo del microscopio medido para un cordón de poliestireno de 3 μm. Su mínima invasividad en las células de linfoma fue confirmada previamente 32,33, manteniendo la capacidad de manipular células vivas.</li>
	<li>Mientras tanto, inicie el software de la computadora. En la ventana del software, aparecerá una imagen de la muestra del microscopio. Utilice los marcadores visibles en la pantalla para mover la trampa óptica en la dirección deseada.</li>
	<li>Una vez que el sistema esté listo, agregue 30 μL de agua desionizada al centro del objetivo inferior. NOTA: El sistema personalizado utiliza un objetivo de inmersión en agua; Sin embargo, los medios de inmersión pueden diferir según la configuración del usuario.</li>
	<li>Coloque una placa de cultivo celular de 35 mm (ver Tabla de Materiales) con fondo de vidrio en la platina del microscopio. Estabilice el plato con los soportes.</li>
	<li>Levante el objetivo con el tornillo del microscopio micrométrico hasta que la gota de agua toque el fondo de vidrio del plato.</li>
	<li>Con el tornillo micrométrico, ajuste suavemente la etapa microscópica hasta que vea el rayo láser nítido en un solo punto brillante en la pantalla. Una imagen de la muestra del microscopio estará presente en la ventana del software. Utilice los marcadores visibles en la pantalla para mover la trampa óptica en cualquier dirección deseada.</li>
	<li>Añadir 100 μl de suspensión de células de linfoma previamente preparada (ver punto 3.5) en el centro del plato con fondo de cristal. Deja que se hundan hasta el fondo del plato durante aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Usando los movimientos de la etapa del microscopio, encuentra una célula de linfoma flotante. Permita que la trampa óptica golpee la muestra haciendo clic en el cursor de la trampa en la pantalla. Intente mover la celda a la ubicación deseada. Una célula, para ser útil para la manipulación, debe ser capaz de moverse fácilmente en la dirección dada. NOTA: Según nuestra observación, entre el 5 y el 10% de las células de linfoma agregadas al plato de vidrio se adherirán permanentemente al fondo después del período de incubación. Este porcentaje aumentará con la duración de la manipulación y puede alcanzar el 30% después de 60 min. Sin embargo, a pesar de estas pérdidas, el número de células añadidas inicialmente a la placa permitirá tanto una calibración eficaz del sistema como la cobertura del esferoide con células de linfoma.</li>
</ol>
5. Generación de esferoides híbridos mediante pinzas ópticas
<ol>
	<li>Retire con cuidado un solo esferoide estromal de un pocillo del molde de agarosa con una punta de pipeta (100-1000 μL) y colóquelo en una placa con fondo de vidrio de microscopía de 35 mm.</li>
	<li>Añadir 2 mL de medio de cultivo RPMI e incubar durante 10 min a 37 °C en condiciones estándar. Durante este tiempo, el esferoide se adherirá suavemente al vidrio, lo que evita el movimiento durante la manipulación.</li>
	<li>Coloque la placa que contiene el esferoide en la platina del microscopio y estabilice la placa en la platina microscópica con los soportes.</li>
	<li>Añadir cuidadosamente 100 μL de solución de células de linfoma a una densidad final de 1 x 104 células/mL (paso 3.5). Deja que se hundan hasta el fondo del plato durante aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Usando los movimientos de la etapa del microscopio, encuentre una célula de linfoma flotante. Permita que la trampa óptica golpee la casilla seleccionada haciendo clic en el cursor de la trampa en la pantalla. Una vez que la célula esté atrapada y móvil, mueva la platina del microscopio para poner la célula en contacto con la superficie del esferoide estromal.</li>
	<li>Comience uniendo la célula del linfoma a la superficie del esferoide estromal durante 10 s. A continuación, compruebe si la célula está unida de forma permanente con tres intentos repetidos de separar la célula del linfoma con las pinzas ópticas.</li>
	<li>Si se rompe el contacto celular, fije la célula del linfoma a la superficie del esferoide una vez más utilizando la trampa óptica; sin embargo, esta vez por un período de tiempo más largo, aproximadamente 20 s. NOTA: Es esencial determinar intervalos de tiempo específicos para el atrapamiento de una sola celda para cada línea celular por separado. En manipulaciones preliminares, se estableció que las células de linfoma de la línea celular Ri-1 exhiben una fuerte propiedad adhesiva a los esferoides estromales, adhiriéndose predominantemente en 10-20 s a su superficie. Por lo tanto, los intervalos de tiempo de contacto específicos para el atrapamiento de una sola célula Ri-1 fueron de 10, 20 y 30 s. Debido a la naturaleza lenta del procedimiento, se recomienda utilizar líneas celulares con un tiempo de adhesión mínimo de no más de 30 s para la formación de esferoides con pinzas ópticas.</li>
	<li>Repita el procedimiento con las células de linfoma subsiguientes hasta que toda la superficie del esferoide estromal esté cubierta por células de linfoma.</li>
	<li>Para cubrir uniformemente la superficie disponible del esferoide estromal con células de linfoma, es necesario cambiar la posición de la trampa óptica en el volumen de la muestra microscópica. Al cambiar el plano de imagen con el tornillo del microscopio micrométrico, se puede cambiar la posición de la trampa óptica, lo que permite un movimiento más profundo de los objetos atrapados en la muestra.</li>
	<li>Para representar mejor el esferoide formado espontáneamente, cubra el núcleo de las células estromales con 2-3 capas de células de linfoma.</li>
	<li>Transfiera el plato con fondo de vidrio que contiene el esferoide a una incubadora durante 1 h de incubación en condiciones estándar. NOTA: El esferoide híbrido puede cultivarse a largo plazo en 20 μL de medio RPMI en una gota colgante.</li>
</ol>
6. Determinación de la viabilidad de los esferoides
<ol>
	<li>Evalúe la viabilidad del esferoide celular utilizando un kit de tinción vivo/muerto (consulte la tabla de materiales). Retire suavemente el medio de cultivo y lave directamente el esferoide con 100 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Incubar el esferoide en 100 μL de 1x solución de PBS que contenga 1 μM de calceína-AM y 2 μM de homodímero-1 de etidio durante 20 min a 37 °C.</li>
	<li>Observe los esferoides usando un microscopio de fluorescencia (ver Tabla de Materiales) y capture las imágenes (ver Tabla de Materiales). NOTA: No es necesario lavar el esferoide después de la tinción. Los niveles de fluorescencia de fondo son inherentemente bajos con este ensayo porque los tintes son prácticamente no fluorescentes antes de interactuar con las células.</li>
	<li>Utilizando el programa ImageJ (ver Tabla de Materiales), determine la viabilidad del esferoide calculando la relación entre el área teñida de verde (células vivas) y el área total teñida de rojo (células muertas) y verde.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Plato 35 mm, fondo de vidrio alto</td><td>IBIDI</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>12-256 mico-molde 3D PetriDish&nbsp;</td><td>Microtejidos Inc., RI, EE. UU.</td><td>12-256TR</td><td></td></tr><tr><td>3 y micro; m microesferas de poliestireno</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti CD20 (clon L26)</td><td>Dako</td><td>IS604</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>EVE/ EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Dako</td><td>D09634</td><td></td></tr><tr><td>Cámara&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TV0.63XC</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture Incubadora de CO2</td><td>Esco Technologies, Inc.</td>Portaobjetos de recuento de células <td>CCL</td><td></td></tr><tr><td>, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>NE-EVS</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular HS-5</td><td>ATCC</td><td>CRL-3611</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular Ri-1&nbsp;</td><td>DSMZ&nbsp;</td><td>ACC 585</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Programa ImageJ Institutos</td><td>Nacionales de Salud, MD, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos vivos/muertos&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio al 0,9 %, estéril</td><td>ITW Reactivos ITW, S.R.L.agentes, S.R.L.</td><td>A1671</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1X), sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Configuración de pinzas ópticas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espejos dicroicos</td><td>Thorlabs DMSP805R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Mikrotron GmbH</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>Galvano-espejo Sistema de escaneo XY</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Lente 1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lente 2</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-200-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 1064 nm</td><td>láser Láser Quantum</td><td>Ventus</td><td></td></tr></tbody></table>

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