Análisis por citometría de masas de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular

La citometría de masas nos permite analizar las respuestas inmunitarias sistemáticas y locales en el carcinoma hepatocelular. Al perfilar las células inmunitarias a nivel de una sola célula, identificamos subconjuntos únicos y los estados funcionales relacionados con la progresión tumoral, ofreciendo información sobre los mecanismos de evasión inmunitaria y los posibles objetivos terapéuticos para tratamientos personalizados. Nuestro protocolo utiliza citometría de masas para analizar más de 14 marcadores simultáneamente a nivel unicelular, evitando la superposición espectral observada en la citometría de flujo tradicional. Esto implica la identificación precisa de poblaciones celulares reales y proporciona datos de alta dimensión para un perfil inmunológico detallado y el descubrimiento de biomarcadores.

[Narrador] Para comenzar, descongele la célula mononuclear de sangre periférica congelada y las suspensiones de células de hepatocarcinoma. Después de la recuperación celular, vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS sin calcio ni magnesio. Agregue cisplatino a una concentración final de 0.5 micromolares, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante dos minutos. Para detener la reacción, centrifugar los tubos a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante, luego agregue un mililitro de tampón de tinción celular a cada tubo. Después de centrifugar nuevamente, deseche con cuidado el sobrenadante. Para realizar el bloqueo del receptor de FC, primero, prepare una mezcla de bloques de 50 microlitros para cada muestra, combine 48 microlitros de tampón de tinción celular con dos microlitros de solución de bloqueo de FC. Vuelva a suspender el gránulo celular en la mezcla de bloques e incube. A continuación, agregue 1,1 microlitros de cada anticuerpo por muestra en un tubo marcado para preparar la mezcla de anticuerpos de proteínas de membrana. Aumente el volumen a 55 microlitros con tampón de tinción celular. Transfiera 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos preparada a cada tubo de muestra, lo que eleva el volumen total a 100 microlitros. Luego, agite suavemente las muestras para mezclar antes de incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue un mililitro de tampón de tinción celular a cada tubo de muestra. Centrifugar a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Después del lavado final, agite brevemente el líquido restante con el gránulo de células para volver a suspender completamente las células. Para la tinción de proteínas del núcleo, agregue 500 microlitros de la solución de fijación mixta a las células resuspendidas. Mezcle suavemente las muestras antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, centrifugar a 500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. A continuación, pipetee 1000 microlitros de tampón de permeabilización en cada tubo para lavar las células. A continuación, centrifugar los tubos a 1000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos en cada tubo después de desechar el sobrenadante. Pipetea suavemente las células para que se mezclen bien antes de incubar. A continuación, pipetee 1000 microlitros de tampón de permeabilización a cada tubo, centrifugue nuevamente y luego deseche el sobrenadante. Para fijar las células, agregue un mililitro de formaldehído al 1,6% preparado en PBS en cada tubo de muestra y vórtice para mezclar bien el contenido. Después de incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante. Para la tinción de intercalación nuclear, primero diluya Cell-ID Intercalator Iridium con tampón fijo y de permeabilización. Pipetear un mililitro de la solución de intercalación en cada muestra. Mezclar suavemente y hacer vórtices. Coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche, luego centrifugue como antes. Cuando se complete la incubación, pipetee 1000 microlitros de tampón de tinción celular en el tubo. Centrifugar los tubos a 800 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Finalmente, vuelva a suspender las celdas en 450 a 900 microlitros de agua desionizada. Tiña las células con azul de tripano para el recuento celular antes de un análisis adicional. Para comenzar, encienda el citómetro de masas e inicie el programa. Analizar las muestras en el sistema CyTOF y adquirir los datos de citometría de masas de las células mononucleares de sangre periférica y las muestras de células de hepatocarcinoma. Inicie el software de procesamiento de datos en el instrumento y preprocese la población de células CD45+ en el archivo FCS. Luego, elimine las células muertas mediante tinción de viabilidad, como la exclusión de cisplatino. Gate la población CD45+ para centrarse en las células inmunitarias y exportar la población cerrada para su posterior análisis. Transforme los datos con un cofactor de cinco. A continuación, inicie el software de agrupación e identifique los clústeres principales según el algoritmo SPADE, agrupando las celdas con perfiles de expresión de marcadores similares en clústeres. Aplique la incrustación jerárquica de vecinos estocásticos, o HSNE, para la reducción de dimensionalidad y la identificación de clústeres distintos. A continuación, utilice el paquete del kit CyTOF en nuestro software para realizar la reagrupación de los clústeres principales. Utilice el programa PhenoGraph para identificar subgrupos con parámetros predeterminados. Se identificaron un total de 14 tipos de células distintas en las muestras de células mononucleares de sangre periférica. Los patrones de expresión de marcadores para cada uno de los 14 tipos de células se detallaron en el mapa de calor, mostrando perfiles de expresión únicos para distintas poblaciones celulares. La distribución de estos tipos de células varió entre las muestras, con la muestra D con una mayor proporción de células T CD4, las muestras A y B que muestran un enriquecimiento significativo de células B y CD141+, células dendríticas convencionales, predominantemente presentes en la muestra C. Se identificaron ocho tipos de células en las muestras de tejido, incluidos monocitos, células T, neutrófilos, células asesinas naturales, células B, células dendríticas plasmocitoides, eosinófilos y células dendríticas mieloides. Los perfiles de expresión de marcadores para los tipos de células tisulares indican patrones distintos para cada población celular. Las muestras de tejido mostraron una proporción consistente de tipos de células en todos los pacientes, lo que refleja características inmunológicas compartidas con el carcinoma hepatocelular.