Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

El alcance de esta investigación es estudiar la morfología y la distribución espacial de los parásitos en la vasculatura de la retina utilizando técnicas avanzadas de imagen. Con el fin de proporcionar una visión detallada para demostrar las características morfológicas de los parásitos, el estudio describió un nuevo enfoque que combina la inyección retroorbitaria de agente fluorescente, la tinción inmunofluorescente y el tratamiento de limpieza de tejidos para avanzar en la investigación en nuestro campo.

En comparación con el estado previo a la limpieza del tejido de la retina del ratón, las señales de fondo de los vasos sanguíneos y los parásitos marcados con lactina de tomate fluorescente y PDGFR-beta se reducen significativamente después de la limpieza del tejido, lo que facilita una observación más precisa de su relación espacial.

Nuestros resultados indican que estas técnicas son altamente compatibles para demostrar los parásitos en la vasculatura retiniana en toda la retina montada. La combinación de estas técnicas histológicas es un enfoque eficaz para visualizar las características morfológicas de los parásitos en detalle desde una vista tridimensional.

[Instructor] Para comenzar, coloque al ratón anestesiado en la decúbito lateral derecha con la cabeza hacia la izquierda. Presione suavemente dos dedos en el área periorbitaria para exponer el ojo izquierdo del ratón. Con una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27, perfore suavemente unos dos o tres milímetros en el seno venoso orbital, asegurándose de que el bisel de la aguja esté hacia adelante en un ángulo de 45 grados. Inyecte 0,1 mililitros de lactina de tomate fluorescente en el seno venoso orbitario. Después de cinco minutos de inyección retroorbitaria, eutanasia al ratón y use tijeras quirúrgicas para abrir la cavidad torácica. Inserte una aguja de calibre 24 dos milímetros en el ventrículo cardíaco izquierdo a través del vértice ventricular izquierdo. Realice la perfusión a una velocidad de tres mililitros por minuto con 20 mililitros de solución salina fisiológica al 0,9%, seguidos de 20 mililitros de solución salina fisiológica al 4%. Inyecte 0,1 mililitros de formaldehído al 0,9% en tampón de fosfato molar 0,1. A continuación, coloque el ratón sacrificado de lado y retire la piel que cubre los ojos con unas tijeras. Enuclee los ojos con tijeras y fórceps. Corte el nervio óptico y los tejidos circundantes y levante el ojo. Transfiera el ojo a una placa de 12 pocillos para fijarlo en formaldehído al 4% en tampón de fosfato molar 0.1 durante dos horas. Después de la fijación, crioproteger el ojo en sacarosa al 25% en tampón de fosfato molar 0,1 a cuatro grados centígrados hasta que se hunda hasta el fondo de la solución. Con una pipeta pastor de plástico, transfiera el ojo a una placa de Petri que contenga 0,1 tampones de fosfato molar. Perfore el borde de la córnea con unas tijeras afiladas, corte alrededor de la córnea y el iris y deséchelos. Con fórceps, retire el cristalino y el humor vítreo. Luego, use fórceps finos para separar la retina en forma de copa del centro del ojo. Enjuague la retina con tampón de fosfato molar 0,1 en una placa de Petri limpia. Después de aislar la retina del ratón en forma de copa, incubarla en una incubadora de 20 horas con una solución de Triton X-100 al 2% en tampón de fosfato molar al 0,1 durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera la retina a la solución de bloqueo y gire a 72 RPM en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego, coloque la retina en un tubo de microcentrífuga que contenga los anticuerpos primarios de cabra anti-PDGFR beta en tampón de dilución. Gire el tubo en la coctelera durante dos días a cuatro grados centígrados. Después de dos días, lave la retina dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente. Coloque la retina en el tampón de lavado y transfiérala al agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera la retina a un tubo de microcentrífuga que contenga una solución de un miligramo por mililitro de anticuerpo secundario de burro anti-cabra 488 y 0,2 nanogramos por mililitro de tinción nuclear fluorescente DAPI. Gire el tubo en el agitador a 72 RPM durante cinco horas a cuatro grados centígrados. Lave la retina en una placa de seis pocillos con tampón de lavado durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Incube la retina en un tampón de lavado en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera la retina al reactivo de limpieza de tejidos y gírela suavemente en el agitador a 60 RPM durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la limpieza del tejido, enjuague la retina con tampón de fosfato molar 0,1 en una placa de Petri limpia. Con unas tijeras de resorte, haga cuatro incisiones radiales que alcancen aproximadamente 2/3 del radio de la retina para crear una forma de pétalo. Aplana la retina y móntala en un portaobjetos de microscopio con el interior de la retina hacia arriba. Use un pequeño trozo de papel absorbente para eliminar el exceso de tampón de fosfato. Rodea la retina montada con un espaciador. Rellene el espacio con un reactivo de limpieza de tejido nuevo y coloque un cubreobjetos encima. Escanee las vistas de montaje de la retina etiquetada utilizando el escáner panorámico de corte de tejido. Tome las imágenes de mayor aumento utilizando un sistema de imágenes equipado con una lente de 2X y 10X con aperturas numéricas de 0.40 y 0.95, respectivamente. Capture imágenes de pila 50Z de la retina etiquetada en fotogramas de dos micrómetros. Haga clic secuencialmente en Establecer plano focal inicial, Establecer plano focal final, Establecer tamaño de paso, elija Patrón de profundidad, Captura de imagen y Serie Z para integrar todas las imágenes en una sola imagen enfocada mediante el modo de proyección y topografía. A continuación, capture imágenes utilizando la fluorescencia verde a 499 y 519 nanómetros, la fluorescencia roja a 591 y 618 nanómetros y la fluorescencia azul a 401 y 421 nanómetros. Seleccione secuencialmente Agregar nuevas superficies, elija Configuración de volumen, elija Canal de origen, ajuste la visualización, ajuste el ángulo de la superficie y la instantánea para importar las imágenes confocales de Z-Stack al software de análisis y reconstruir las imágenes en el patrón tridimensional. La transparencia tisular de toda la retina montada aumentó después del tratamiento de limpieza de tejidos en comparación con la retina sin limpieza de tejidos. La vasculatura retiniana marcada con lectina de tomate y los parásitos retinianos marcados con PDGFR-β fueron visibles tanto antes como después de la limpieza del tejido, pero el ruido de fondo se redujo después de la limpieza del tejido. Se observaron parásitos retinianos a lo largo del árbol vascular, mostrando una distribución gradacional desde las regiones central a la periférica de la retina. Las imágenes tridimensionales de Z-Stack de la retina despejada mostraron parásitos envueltos firmemente alrededor de los vasos retinianos de diferentes diámetros con una tinción más fuerte de PDGFR-β en los capilares.