Name: Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a visualizar pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 3D. Este método combina inyección retroorbital, tinción con PDGFR-beta y aclarado tisular para mejorar la imagenología.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de pericitos retinianos mediante limpieza de tejidos y marcaje fluorescente

<ol><li>Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cryo-sections%2C+whole-mounts%2C+and+hypotonic+isolated+vasculature+preparations+for+immunohistochemical+visualization+of+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes.</a> J Vis Exp. (140), e57733(2018).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. (77), e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nat Commun. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+receptor-beta+is+differentially+regulated+in+primary+mouse+pericytes+and+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices.</a> Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+hairy+and+glabrous+skin+innervation+in+a+3d+pattern+using+multiple+fluorescent+staining+and+tissue+clearing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches.</a> J Vis Exp. (183), e63807(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> J Vis Exp. (167), e61742(2021).</li>
<li>Batista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normative+mice+retinal+thickness%3A+16-month+longitudinal+characterization+of+wild-type+mice+and+changes+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease.</a> Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-endothelial+interactions+in+the+retinal+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+an+anti-angiogenic+peptide+inhibits+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+of+fitc-dextran+is+an+effective+and+economical+method+for+observing+mouse+retinal+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels.</a> Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).</li>
<li>Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cells+expressing+ng2+and+platelet-derived+growth+factor+receptor-%CE%B2+in+the+fibrotic+scar+formation+after+3-nitropropionic+acid-induced+acute+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury.</a> Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cubic+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> J Vis Exp. (114), e54401(2016).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+clarity+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Pericyte morphology and function.</a> Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).</li>
<li>Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mechanics+and+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte mechanics and mechanobiology.</a> J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+dysfunction+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neurovascular dysfunction in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).</li>
<li>Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+vascular+cognitive+impairment+and+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia.</a> Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratón Beijing</td><td>Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>SCXK (Jing) 2021-0006</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes confocales</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGFR-&beta;</td><td>Investigación y Desarrollo</td><td>AF1042</td><td>25 &micro; g&nbsp;</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Lycopersicon esculentum (tomate) lectina, DyLight594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32471</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td> de 1 mg <td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Escáner panorámico de corte de tejido</td><td>Olympus</td><td>VS120-S6-W</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop y&nbsp; Ilustración</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 Solución</td><td>SunJin Lab</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Placa de seis pocillos</td><td>Tijeras</td> de resorte Costar <td>3335</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr></tbody></table>

visualización 3d de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

A partir de las vistas externas de la retina de montaje completo, la transparencia del tejido de la retina de montaje completo aumentó con el tratamiento de limpieza de tejidos en comparación con la de la retina sin limpieza de tejidos (Figura 1).
Para el examen histológico de la retina de montaje completo, la vasculatura de la retina se marcó en rojo con lectina fluorescente de tomate a través de la inyección retroorbitaria, y los pericitos de la retina se muestran en verde con PDGFR-β (Figura 2, Figura 3 y Figura 4). Aunque se pudo observar este marcaje en la muestra antes y después del aclaramiento del tejido, a modo de comparación, el ruido de fondo de la muestra de retina se redujo con el tratamiento de aclarado del tejido (Figura 2). El tratamiento también hizo que los pericitos y la vasculatura de la retina marcados fueran más claros bajo el escáner panorámico de corte de tejido (Figura 2) y el microscopio confocal de barrido láser (Figura 3).
La distribución gradacional de los pericitos retinianos también se demuestra aquí a lo largo del árbol vascular retiniano (Figura 3). Desde la parte central de la retina hasta su región periférica, los pericitos se localizan en la membrana basal de la vasculatura retiniana, incluyendo el tronco y las ramas vasculares y los capilares (Figura 3).
Sobre la base de la observación anterior, la correlación espacial de los pericitos y la vasculatura de la retina se evaluó más a fondo con las imágenes de la pila Z de mayor aumento de la muestra de retina aclarada (Figura 4). Con la ayuda del sistema de procesamiento de imágenes, proporcionamos además las vistas 3D para demostrar que los pericitos estaban firmemente envueltos alrededor de la vasculatura de la retina en diferentes diámetros (Figura 4). La figura 4A0-D0 representa la ramificación jerárquica de los vasos de la retina de mayor a menor. Dado que los pericitos se distribuyen más abundantemente en los capilares, la tinción de PDGFRβ en la Figura 4D0 muestra una intensidad y señal más fuertes en comparación con la Figura 4A0-C0.
A diferencia de la retina de ratón sin tratamiento de limpieza de tejidos (Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A0-D0), el enfoque actual ha reducido eficazmente las señales de fondo de la retina para demostrar la relación espacial entre los pericitos y los vasos sanguíneos de la retina de montaje completo (Figura 1B, Figura 2B, Figura 3A1-D1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig01.jpg"> 
Figura 1: Comparación de la transparencia óptica de toda la retina del monte sin y con el tratamiento de limpieza de tejidos. (A, B) Las vistas externas de toda la retina del monte antes (A) y después de (B) el tratamiento de limpieza de tejidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig02.jpg"> 
Figura 2: Comparación de las características de marcaje de los pericitos y la vasculatura de la retina de toda la montura de la retina sin y con el tratamiento de limpieza de tejidos. (A, B) Se tomaron vistas de montaje representativas de toda la retina de la montura antes de (A) y después de (B) tratamiento de limpieza de tejidos bajo el sistema de portaobjetos virtual. La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig03.jpg"> 
Figura 3: Comparación de la resolución de imagen de los pericitos retinianos gradacionalmente a lo largo del árbol vascular de la retina antes y después del tratamiento de limpieza de tejidos. (A-D) Las imágenes representativas de la retina marcada antes del tratamiento de limpieza de tejidos (A0-D0) y después del tratamiento de limpieza de tejidos (A1-D1) muestran la distribución de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina en orden de tronco vascular (A0, A1), las ramas de primer orden (B0, B1), las ramas de segundo orden (C0, C1) y el capilar (D0, D1). La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig04.jpg"> 
Figura 4: Correlación espacial de pericitos con vasculatura retiniana en diferentes diámetros. (A-D) Imágenes representativas de alta resolución de la retina marcada a lo largo del árbol vascular de la retina que muestran la distribución de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina en diferentes diámetros, incluyendo el tronco vascular (A0, A1), las ramas de primer orden (B0, B1), las ramas de segundo orden (C0, C1) y el capilar (D0, D1). A1-D1: Las imágenes correspondientes de los paneles A0-D0 se reconstruyeron para mostrar la correlación espacial de los pericitos con la vasculatura de la retina en diferentes diámetros en las vistas tridimensionales y demostrar aún más las vistas ampliadas de las regiones locales en los paneles A1-D1 (flechas) con inserciones. La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

3d-visualization-retinal-vascular-pericytes-mice

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Investigación

JoVE Journal

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