Name: Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a aislar vesículas extracelulares intersticiales de músculo esquelético en roedores mediante digestión enzimática y ultracentrifugación diferencial. Este protocolo permite obtener vesículas de alta pureza para estudiar homeostasis muscular y enfermedades neuromusculares.

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<meta charset="utf8"></head><body>Aislamiento optimizado de VE derivados del músculo esquelético para la investigación y la terapéutica

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6</td><td>mL ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo de 1,5 mL (C)&nbsp;</td>Tubos de microcentrífuga <td>Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td><td>Transparente, graduado, no estéril</td></tr><tr><td>Jeringa BD de 5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp;</td><td>Consejo Luer-Lok</td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células, doble cámara para contador</td><td>de células Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>Solución de limpieza</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) Líquido (-calcio,-magnesio)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>La dilución final utilizada es 1x</td></tr><tr><td>DPBS/Modificado (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD Pure Dispensador remoto de agua</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 Rotor de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 Horno de protocolo general</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>Convección por gravedad, 2.3 pies cúbicos 120 V</td></tr><tr><td>MemGlow-488 Sonda</td><td>Citoesqueleto Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Millipak Millipore Especial</td><td>Millipore Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ER LTS 1000&micro; L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ER LTS 20&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ER LTS 200&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>cuentas de control de calidad</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT Rotor de ángulo fijo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45539</td><td>1,10,000 rpm</td></tr><tr><td>S16 exo 65-155nm</td><td>perlas NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>SPI, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Ultracentrífuga Sorvall mX 150+</td><td></td><td>Contador</td> de celdas automatizado ThermoFisher Scientific 50135641 <td></td></tr><tr><td>TC 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripán</td><td>Pinzas Pinzas Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPI, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga VWR de 15 ml</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 Filtros</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0.45 &micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Ratones C57BL/6J de tipo salvaje</td><td>Stock de Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

Siguiendo este protocolo, se extrajeron con éxito vesículas extracelulares del músculo esquelético (SkM-EV) de varios grupos musculares, incluidos el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL), el sóleo (SOL), el gastrocnemio (GAS) y el cuádriceps (QUA) de ratones de tipo salvaje. La caracterización posterior de estos SkM-EV se llevó a cabo mediante citometría de nanoflujo, dilucidando sus características distintivas como se resume en la Tabla 1. Sorprendentemente, a partir de solo 1 g de...

Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

enzymatic-isolation-skeletal-muscle-interstitial-extracellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Aquí describimos el enriquecimiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado a través de un método optimizado de ultracentrifugación diferencial.

Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a aislar vesículas extracelulares intersticiales de músculo esquelético en roedores mediante digestión enzimática y ultracentrifugación diferencial. Este protocolo permite obtener vesículas de alta pureza para estudiar homeostasis muscular y enfermedades neuromusculares.

Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

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