Name: Desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en Brassica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a desarrollar un sistema de protoplastos de repollo para estudiar la tolerancia a la hipoxia en Brassica. Este método permite analizar respuestas moleculares al estrés por inundación en vegetales.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistema eficiente de Protoplast de repollo para estudiar los mecanismos de tolerancia a las inundaciones

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr><tr><td>228 semillas de col</td><td>Takii & Co., Ltd. (Kioto, Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Alpha Plus</td><td>16106</td><td>Para la incubación de protoplastos</td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro de células</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>SCS701</td><td>Para la filtración de protoplastos</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 9 cm</td><td>Alpha Plus</td><td>16001</td><td>Para la digestión enzimática</td></tr><tr><td>Tarro anaeróbico</td><td>HIMEDIA</td><td>Tarro anaeróbico 3,5 L</td><td>Para el tratamiento de la hipoxia&nbsp;</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Para la preparación de soluciones W5 y el recubrimiento</td></tr><tr><td>de placas de cultivo Cloruro de calcio</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>Para la preparación de soluciones W5 y PEG</td></tr><tr><td>Celulasa R10</td><td>Yakult</td><td></td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>402030</td><td>Para infiltración al vacío</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td>Para la preparación de soluciones W5</td></tr><tr><td>Medidor de oxígeno disuelto</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Star A223</td><td>Para la medición</td></tr><tr><td>de oxígeno D-Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas, soluciones de PEG y MMG</td></tr><tr><td>Sistema de ensayo Dual-Luciferasa Reporter Promega</td><td></td><td>E1960</td><td>para el ensayo reportero de luciferasa dual</td></tr>, <tr><td>EC-Oxyrasa</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>EC-0005</td><td>Para el tratamiento de la hipoxia</td></tr><tr><td>Semillas de col Fuyudori</td><td>Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidad</td><td>Hitachi</td><td>CR21GIII</td><td>Para la cosecha de protoplast</td></tr><tr><td>Macerozyme R10&nbsp;</td><td>Yakult</td><td></td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>Para la preparación de soluciones MMG</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Hitachi</td><td>CT15RE</td><td>Para la cosecha de protoplast</td></tr><tr><td>Microplaca</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>para ensayo reportero de luciferasa dual Lector de</td></tr><tr><td>microplacas Molecular</td><td>Devices</td><td>SpectraMax Mini</td><td>para Ensayo reportero de luciferasa dual</td></tr><tr><td>Millex 0,22 &mu; m filtro de jeringa</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr><tr><td>Bomba de vacío sin aceite</td><td>Balancín&nbsp;</td><td>Balancín 300</td><td>Para infiltración al vacío</td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td>Para el tratamiento de la hipoxia</td></tr><tr><td>Paquete absorbente de oxígeno</td><td>Mitsubishi Gas Chemical Company</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>Para el tratamiento de la hipoxia</td></tr><tr><td>Concentrador de oxígeno</td><td>MAXIMUM PERFECT</td><td>AII-X</td><td>Para el burbujeo de oxígeno en solución W5</td></tr><tr><td>Sustrato vegetal</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Sustrato Potgrond H</td><td>Para la preparación de plántulas de col</td></tr><tr><td>Kit Midi de plásmido</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>Para la purificación de ADN plásmido de grado de transfección&nbsp;</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td>Para la transfección de protoplastos</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>Para la preparación de soluciones W5</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar</td><td>Gillette</td><td></td><td>Para la preparación de tiras de hojas de col</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td>Para la preparación de soluciones W5</td></tr><tr><td>Sulfito de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td>Para el tratamiento de la hipoxia</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td><td>Para la preparación de soluciones enzimáticas</td></tr></tbody></table>

desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en brassica

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

Este trabajo desarrolló con éxito un sistema de expresión transitoria utilizando protoplastos de repollo (consulte la Figura 1 para el flujo de trabajo). Los protoplastos se aislaron de hojas verdaderas de repollo de 2 a 3 semanas de edad de tamaño apropiado (Figura 2A) de los cultivares comerciales de repollo 'Fuyudori' y '228' utilizando digestión con celulasa/macerozima e infiltración al vacío oscuro (Figura 2B, C). Para mitigar las condiciones hipóxicas experimentadas por los protoplastos sumergidos durante la incubación, la solución W5 se oxigenó utilizando un burbujeador de piedra difusora conectado a una máquina de oxígeno (Figura 2D). Este proceso elevó significativamente la concentración de oxígeno disuelto en la solución W5 de 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29.18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 después de 5 min de burbujeo de oxígeno. Tras el proceso de aislamiento, el rendimiento de protoplastos fue de 1,04 x 107 para 'Fuyudori' y de 4,00 x 106 protoplastos·g-1 de peso fresco para '228' después de un período de digestión durante la noche (Figura 2E). Posteriormente, se utilizó GFP como gen reportero para evaluar la eficiencia de transformación del método de transfección mediado por PEG, demostrando una eficiencia de transfección de protoplasto en repollo superior al 40% en ambos cultivares (Figura 2F), confirmando así la viabilidad de este sistema.
Además, se introdujeron construcciones promotoras de los genes de respuesta a la respiración anaeróbica de la col, los vectores BoADH1p::Luc y BoSUS1Lp::Luc (Figura 3A), en los protoplastos de la col como indicadores para evaluar los efectos de la inducción hipóxica de varios tratamientos. También se aplicaron varios tratamientos de ajuste de oxígeno a este sistema modelo de expresión transitoria. Los resultados mostraron que todos los tratamientos de eliminación de oxígeno, con la excepción del sulfito de sodio, indujeron con éxito una respuesta de hipoxia en los protoplastos de repollo (Figura 3B). En concreto, la actividad promotora de BoADH1 aumentó aproximadamente 2,6 veces y 3,2 veces en comparación con el control tras el tratamiento con EC-Oxyrasa y OxyFluor, respectivamente, y, en particular, más de 7,0 veces con el tratamiento con paquetes absorbentes de oxígeno (Figura 3B). Del mismo modo, la actividad del promotor de BoSUS1L aumentó aproximadamente 1,7 veces y 1,8 veces con el tratamiento con EC-Oxyrasa y OxyFluor, respectivamente, mientras que el tratamiento con paquetes absorbentes de oxígeno indujo un aumento sustancial de más de 5,6 veces (Figura 3B). Estos resultados sugieren que el paquete absorbente de oxígeno demuestra una eficacia superior en la creación de un ambiente hipóxico en este sistema experimental de protoplasto de repollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
Figura 1: Representación gráfica del flujo de trabajo de aislamiento de protoplastos. Esta figura ilustra el proceso paso a paso involucrado en el aislamiento de protoplastos del tejido de la hoja de repollo. El flujo de trabajo se representa visualmente para proporcionar una comprensión clara del procedimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Aislamiento de protoplastos a partir de tejido foliar de repollo. (A) Se muestra el aspecto de las variedades comerciales de repollo 'Fuyudori' y '228' en la etapa de crecimiento recomendada. Las segundas hojas verdaderas recién expandidas (indicadas por la punta de flecha) de las coles en la etapa de 2 hojas se seleccionan para el aislamiento de protoplastos. Barra de escala: 2 cm. (B) Se emplea una bomba de vacío y un desecador para el proceso de infiltración al vacío de tiras de hojas de col, con una infiltración de 30 min realizada antes de la digestión enzimática. (C) Se describe la condición de las tiras de hojas de repollo durante la digestión enzimática. La digestión completa del tejido foliar requiere un total de 4-16 h. Barra de escala: 3 cm. (D) Las fotos muestran el uso de un concentrador de oxígeno conectado a una piedra difusora para aumentar la concentración de oxígeno disuelto en la solución W5. Barra de escala: 5 cm. (E) Se obtuvieron más de 4,00 x 106 protoplastos mesófilos por gramo de peso fresco (PV) de las variedades de repollo 'Fuyudori' y '228' y se observaron bajo un microscopio. Barra de escala: 200 μm. (F) Se muestra que la eficiencia de transfección de los protoplastos de ambos genotipos de repollo, utilizando un indicador de GFP expresado constitutivamente, es superior al 40%. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
Figura 3: Respuesta a la hipoxia de los protoplastos de la col en condiciones de deficiencia de oxígeno. (A) Las construcciones génicas de respuesta a la hipoxia, promotores BoADH1 y BoSUS1L , se utilizan como indicadores para evaluar la respuesta a la hipoxia en los protoplastos de la col 'Fuyudori'. (B) Un total de 5 μg de plásmidos reporteros se transfectan en protoplastos de col 'Fuyudori', que se incuban en una solución W5 con burbujas de oxígeno antes de la exposición a tratamientos de hipoxia durante 4 h. Los niveles de oxígeno se reducen durante la incubación mediante la adición de EC-oxirasa (0,6 unidades·mL-1), OxyFluor (0,6 unidades·mL-1) y sulfito de sodio (1 g·mL-1) a la solución W5. El tratamiento del paquete absorbente de oxígeno se realiza colocando dos bolsas absorbentes de oxígeno en un frasco anaeróbico de 3,5 L. El grupo "CK" representa el grupo de control sin ningún tratamiento de hipoxia. Después del tratamiento, los protoplastos se recolectan para un ensayo de luciferasa dual. Cada valor representa la media ± DE, con n = 4. Diferentes letras indican diferencias significativas (P &lt; 0,05) en base a un ANOVA de un factor con prueba post-hoc de LSD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Preparación de la solución enzimática, la solución W5 y la solución MMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Ficha complementaria 1: Detalles del plásmido para la transfección de protoplastos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en Brassica

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

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Investigación

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Biología

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Aprende a desarrollar un sistema de protoplastos de repollo para estudiar la tolerancia a la hipoxia en Brassica. Este método permite analizar respuestas moleculares al estrés por inundación en vegetales.

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