Desarrollo de un sistema de protoplasto de repollo para el estudio de la tolerancia a la hipoxia en Brassica
20 de septiembre de 2024
Este protocolo describe un sistema eficiente de protoplasto mesophyll de repollo. Se probaron varios tratamientos con deficiencia de oxígeno y el sistema mostró una alta activación de genes que responden a la hipoxia, lo que facilitó los estudios de los mecanismos genéticos y moleculares de la tolerancia a la inundación en vegetales Brassicaceae .
Estamos estudiando cómo reaccionan las coles a la falta de oxígeno a nivel molecular. Dado que las coles son difíciles de obtener, estamos desarrollando un sistema utilizando células de repollo aisladas. Al exponer estas células de repuesto, también conocidas como protoplastos, a condiciones de bajo oxígeno, podemos investigar fácilmente su respuesta al estrés.
Trabajar con protoplasto suspendido en solución para estudiar las respuestas a niveles bajos de oxígeno es complicado. El gran desafío es mantener suficiente oxígeno para nuestras muestras de control. Descubrimos una manera de bombear el oxígeno del líquido.
Hemos validado el método a través de ensayos reporteros de marcadores de hipoxia. Revisamos diferentes métodos para manejar el bajo nivel de oxígeno y descubrimos que el paquete de absorción de oxígeno funciona mejor. Es fácil de usar y eficaz, por lo que es ideal para estudiar cómo se comportan los protoplastos en condiciones de bajo oxígeno.
El estudio del mecanismo molecular en cultivos de hoja en condiciones de hipoxia ha sido un desafío debido a la limitación de las herramientas disponibles, pero con los avances recientes, hemos logrado un gran progreso mediante el uso de un sistema de protoplasto de repollo con tratamiento de hipoxia. Este nuevo método nos está ayudando a comprender cómo el bajo nivel de oxígeno afecta a estas plantas a nivel molecular. En el futuro, planeamos combinar el sistema de protoplast con inmunoprecipitación y ensayos reporteros para ilustrar la vía de regulación molecular involucrada en el repollo durante el estrés por inundación.
Nuestro objetivo es identificar los reguladores clave de la tolerancia a las inundaciones, que esperamos ayudar a mejorar la mejora de un nuevo cultivar de repollo con una mejor tolerancia a las inundaciones. Para comenzar, llene los agujeros redondos de forma cuadrada de una bandeja de tapones de 48 pocillos con sustrato de plantas comerciales y siembre Fuyudori y 228 semillas de repollo aproximadamente a un centímetro de profundidad en el medio de cultivo. Para preparar 12,5 mililitros de solución enzimática, precaliente una solución que contenga 10 milimolares MES y 0,6 molares de manitol a 55 grados centígrados.
A continuación, añadir 1,5% de celulasa R-10 y 0,75% de macerozima R-10. Revuelva la solución y continúe calentando a 55 grados centígrados durante 10 minutos. Deje que la solución enzimática se enfríe a temperatura ambiente.
A continuación, añadir 10 milimolares de cloruro cálcico y 0,1% de albúmina sérica bovina. Con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros, esterilice la solución enzimática en una placa de Petri de nueve centímetros. Después de dos o tres semanas de crecimiento, recoja las plántulas de repollo en la segunda etapa de la hoja para el aislamiento del protoplasto mesófilo.
Recoja las segundas hojas verdaderas recién expandidas de cinco a ocho plántulas de repollo. Con una cuchilla de afeitar afilada, corte las hojas en tiras de 0,5 a 1,0 milímetros. Transfiera inmediatamente las tiras de hojas a la solución enzimática recién preparada.
Someta las tiras de hojas de repollo a la infiltración al vacío en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la infiltración al vacío, mantenga las tiras de hojas sumergidas en la solución enzimática en la oscuridad durante cuatro a 16 horas. Al día siguiente, diluir la solución que contiene protoplastos con un volumen igual de solución W5 para detener la digestión enzimática.
Para liberar la suspensión de los protoplastos, agite suavemente la mezcla en un agitador orbital. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar la solución de protoplasto a 150 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Agregue 10 mililitros de solución W5 a lo largo de la pared del tubo a un caudal de aproximadamente un mililitro por segundo para lavar los protoplastos granulados. Después de la última centrifugación, vuelva a suspender los protoplastos en la solución W5 y coloque el tubo en hielo durante 30 minutos. A continuación, retire un mililitro de sobrenadante a la vez hasta que se elimine todo el sobrenadante.
Vuelva a suspender los protoplastos en una solución de MMG preenfriada con hielo. Mida la concentración de protoplasto con un hemocitómetro. Ajuste la concentración final a 4 veces 10 a la potencia de 5 protoplastos por mililitro usando solución de MMG.
Después del aislamiento y la digestión durante la noche, el rendimiento de protoplastos fue de 1,04 por 10 elevado a 7 para Fuyudori y de 4,00 por 10 a potencia de 6 protoplastos por gramo de peso fresco para 228. La eficiencia de la transfección de protoplastos fue superior al 40% tanto en Fuyudori como en 228 cultivares, como lo demuestra el gen reportero GFP. Después de aislar el protoplasto de repollo, mezcle 100 microlitros de 4 por 10 a la potencia de 4 protoplastos con 10 microlitros de plásmido y coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos.
Agregue un volumen igual de solución de PEG recién preparada a la solución de protoplast y mezcle suavemente. Incubar la mezcla de protoplast a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos. Luego agregue 440 microlitros de solución W5 para terminar la reacción.
Centrifugar los protoplastos transfectados a 150 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet en 750 microlitros de solución W5 enriquecida con oxígeno. Transfiera los protoplastos resuspendidos a una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos precodificada con albúmina sérica bovina al 1%.
Para la hipoxia inducida por la bolsa que consume oxígeno, coloque una placa que contenga la solución de protoplasto W5 en un frasco anaeróbico de 3,5 litros. Luego agregue dos paquetes de absorción de oxígeno en el frasco para crear un ambiente hipóxico. Después del tratamiento, centrifugar los protoplastos a 150 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y congele los protoplastos recolectados en nitrógeno líquido antes de proceder al ensayo de luciferasa dual. El paquete absorbente de oxígeno indujo un aumento de 7,0 veces en la actividad del promotor de BoADH1 en comparación con el control, demostrando la respuesta hipóxica más alta. La actividad del promotor de BoSUS1L aumentó más de 5,6 veces, y el tratamiento con paquete absorbente de oxígeno mostró la mayor inducción entre los tratamientos.
Visión general
Este estudio investiga las respuestas moleculares de los protoplastos de repollo a condiciones de bajo oxígeno, que simulan el estrés por inundación. Al desarrollar un nuevo sistema de protoplastos que mejora el estudio de los genes sensibles a la hipoxia, la investigación tiene como objetivo dilucidar los mecanismos genéticos subyacentes a la tolerancia a la inundación en las verduras de la familia Brassicaceae.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Respuestas al estrés de las plantas
- Tolerancia a la inundación en verduras
- Mecanismos genéticos y moleculares
Antecedentes
- Los repollos son difíciles de obtener, lo que hace necesaria la necesidad de un sistema celular como los protoplastos.
- La investigación sobre las respuestas a la hipoxia en las plantas está limitada por las técnicas disponibles.
- Entender los mecanismos moleculares puede mejorar los esfuerzos de reproducción para una mejor tolerancia a la inundación.
Métodos utilizados
- Desarrollo de un sistema de protoplastos de repollo aislado mediante digestión enzimática.
- Exposición de los protoplastos a condiciones controladas de bajo oxígeno para simular la hipoxia.
- Utilización de ensayos de reporteros para validar la activación de genes sensibles a la hipoxia.
Principales resultados
- Establecimiento exitoso de un sistema de protoplastos con alta eficiencia de transfección.
- Los protoplastos expuestos a tratamientos de absorción de oxígeno mostraron aumentos significativos en la expresión de genes sensibles a la hipoxia.
- Inducción de marcadores clave de hipoxia validada por ensayos de luciferase dual.
Conclusiones
- El estudio destaca un método efectivo para analizar las respuestas moleculares de los repollos al bajo oxígeno.
- Los hallazgos podrían facilitar el desarrollo de cultivares de repollo con mayor tolerancia al estrés por inundación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
