Name: Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a realizar perfiles de polisomas para analizar la eficiencia de traducción en Arabidopsis thaliana bajo estrés térmico. Este protocolo estandarizado utiliza normalización spike-in para estudios translatómicos precisos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análisis de la regulación traslacional en Arabidopsis sometida a estrés térmico

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
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<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
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<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
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<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
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<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9 Extracción de</td><td>ARN</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 13,2 mL</td><td>Ultracentrifugación</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td> Azul de</tr><tr><td>bromofenol Honeywell</td><td></td><td>32712</td><td>Perfil de polisoma</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>Cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Perfil de polisomas</td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>GeneChip Eucariota Poli-A Kit de control de</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td></td></tr><tr><td>Normalización de Glicerol</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>Heparina de normalización</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149 Perfil de</td><td>polisoma</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix para kit de qPCR</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalización</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 3040-01</td><td>Perfil de polisoma</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Perfil de polisoma</td></tr><tr><td>MS medio basal Phyto</td><td></td><td>M524</td><td>Cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Gráfico de picos Bomba de jeringa</td><td>Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Perfil de polisomas</td></tr><tr><td>Polioxietileno-10-Tridecil-éter (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Perfil</td></tr> <tr><td>de polisomasRNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Perfil de polisomas</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Perfil de polisoma</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Perfil de polisoma</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalización</td></tr><tr><td>Reactivo TRI MRC</td><td>TR118</td><td>Extracción de ARN</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06 Perfil de</td><td>polisoma</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>ultracentrifugación</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Perfil de polisoma</td></tr></tbody></table>

prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

El tipo silvestre de Arabidopsis, Col-0, se cultivó en medio MS bajo un fotoperiodo de luz de 16 h:8 h. Para el control, se utilizaron plántulas de 5 días de edad sin tratamiento de estrés térmico. El grupo de estrés térmico se sometió a 1 h de tratamiento térmico a 40 °C en un baño de agua precalentado, mientras que el grupo de recuperación se colocó a 22 °C durante 2 h inmediatamente después del tratamiento térmico. Al emplear diferentes condiciones de tratamiento térmico y condiciones de recuperación, podemos utilizar los pasos posteriores para medir su eficiencia de traslación.
Antes de la extracción del ARN, primero se debe preparar el gradiente de sacarosa. Para separar el ARN polisomal y no polisomal en función de su diferencia de densidad, preparamos una solución de gradiente con concentraciones de sacarosa de 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% y 60%. A continuación, cargamos las soluciones de gradiente de alta a baja concentración, empezando por la parte inferior (Figura 1A). Posteriormente, podemos utilizar este gradiente para separar el ARN no polisomal de menor densidad en la capa superior, mientras que el ARN polisomal de mayor densidad se distribuirá en la capa inferior con mayores concentraciones de sacarosa. El ARN polisomal y no polisomal se extrajo del Col-0 tratado o no tratado. Para evitar que las partículas de la solución afecten a los resultados del análisis de perfiles de polisomas, la solución que contiene ARN debe filtrarse a través de un filtro celular para obtener una solución de extracción sin partículas. El sobrenadante filtrado se cargó en un gradiente de sacarosa preparado previamente y se equilibró. Después de la ultracentrifugación de las muestras cargadas con gradiente de sacarosa, el ARN polisomal y no polisomal se distribuyó según la densidad dentro del gradiente de sacarosa. Posteriormente, se realizó el perfilado de polisomas utilizando un fraccionador de gradiente de densidad (Figura 1B). El fraccionador de gradiente de densidad se controla mediante un software calibrado inicialmente con agua desionizada. Después de la calibración, las muestras se cargan en el fraccionador después de la ultracentrifugación. Operando en modo de control de software, la bomba de jeringa de microvolumen inyecta solución de sacarosa con concentraciones más altas que el gradiente de sacarosa en el gradiente, empujando la muestra. Esto permite que la medición comience desde la parte superior del gradiente de sacarosa, donde la densidad es menor, y continúe hacia la parte inferior, donde la densidad es mayor. Posteriormente, se activan los ajustes del software para comenzar la adquisición de datos, generando el gráfico del perfil del polisoma a través de la medición de OD254 (Figura 1B). Cuando observamos una mayor intensidad de señal en la fracción polisomal, indica que la muestra exhibe una mayor eficiencia de traducción.
En la Figura 2 se muestran las parcelas de perfilado de polisomas para plántulas de Col-0 de 5 días de edad bajo diferentes tratamientos. Los resultados del grupo control demuestran una clara separación entre la fracción no polisomal y la fracción polisomal (Figura 2A). Sin embargo, después de 1 h de estrés térmico a 40 °C, la intensidad de la señal de la fracción polisomal disminuyó significativamente (Figura 2B). Cuando se permitió que las plántulas tratadas térmicamente se recuperaran a 22 °C durante 2 h, la intensidad de la señal de la fracción polisomal se recuperó a un nivel similar al grupo control (Figura 2C). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento de estrés térmico de 1 h redujo significativamente la eficiencia de traslación de las plántulas de Arabidopsis. Sin embargo, las plantas requirieron 2 h de recuperación para restaurar la eficiencia de traslación a niveles comparables a los de las plántulas que no sufren estrés por calor.
Para recopilar más evidencia que compare la eficiencia de traducción de las plántulas de Col-0 en diferentes condiciones de tratamiento, aislamos y extrajimos las fracciones de ARN polisomal y no polisomal. La recolección de fracciones de ARN polisomales y no polisomales se guió por los resultados de las mediciones del perfil de polisomas. Para la extracción de ARN polisomal y no polisomal, utilizamos el reactivo de tiocianato de fenol/guanidinio para extraer las muestras aisladas de ARN polisomal y no polisomal. Con el método de extracción de ARN que utilizamos, podemos obtener ARN estable y de alta calidad para nuestro siguiente análisis (Tabla 1). Posteriormente, normalice el ARN extraído con el kit de control de ARN poli-A eucariota GeneChip para mitigar los errores causados por las diferentes pérdidas de extracción. A continuación, se utilizó la PCR en tiempo real para cuantificar la expresión de los genes DAP , que se incluyen en los genes de B. subtilis añadidos al kit. Se realizó un análisis comparativo de los niveles de expresión génica de DAP entre los grupos de ARN polisomal y no polisomal para estimar el contenido de ARN en condiciones de pérdida proporcional (Figura 3A). Calculamos la relación entre el ARN polisomal normalizado y el ARN total para aclarar la eficiencia de traducción entre ellos (Figura 3B). Finalmente, se calculó la proporción de ARN en los polisomas utilizando el contenido de ARN normalizado (Figura 3C). Los resultados de la proporción de ARN en polisomas bajo diferentes tratamientos con Col-0 exhibieron un patrón consistente con los resultados del perfil de polisomas que se muestran en la Figura 2A. Ambos resultados indican que el estrés térmico reduce significativamente la relación ARN en la fracción polisomal, y este efecto puede revertirse después de una recuperación de 2 h a 22 °C (Tabla 1).
A partir de este método, podemos obtener la fracción completa de ARN polisomal o polisomal con alta calidad en lugar de separar el ARN en fracciones adicionales23. Nuestros resultados también demuestran que tanto los perfiles de polisomas como el porcentaje de ARN en los polisomas pueden reflejar eficazmente la eficiencia de la traducción en Arabidopsis con diferentes condiciones tratadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo de perfilado de polisomas. (A) Ilustración esquemática de la preparación del gradiente de sacarosa en un tubo de centrífuga de 13 mL. (B) El diagrama de flujo ilustra el proceso experimental de perfilado de polisomas. En primer lugar, se extrae el translátomo. Posteriormente, el ARN polisomal y no polisomal se separa en función de sus diferencias de densidad mediante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa de diferentes densidades. OD254 se mide utilizando un fraccionador de gradiente de densidad para obtener el gráfico de resultados de perfil de polisomas a continuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Figura 2: Perfil de polisomas de Col-0 en diferentes condiciones. (A, B, C) El perfil de polisomas da como resultado Col-0 en condiciones de (A) sin tratamiento térmico (control), (B) tratamiento térmico a 40 °C durante 1 h y (C) recuperación a 22 °C durante 1 h después del tratamiento térmico. El ARN polisomal y no polisomal se fraccionó utilizando un gradiente de sacarosa del 12,5%-60%. Las posiciones del ARN no polisomal (NP) y polisomal (PL) se indican en los perfiles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama del flujo de trabajo de extracción de ARN polisomal y no polisomal. (A) Una ilustración de la normalización del ARN por espiga. (B) Una ilustración de la separación de ARN polisomal y no polisomal y el cálculo del porcentaje de ARN polisomal. (C) El porcentaje de ARN polisomal en Col-0 tratado con diferentes afecciones. Las barras de error indican la media ± SD (n=3 repeticiones biológicas). *Valor p &lt; 0,01, prueba t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Contenido (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Control</td>
			<td>ARNNP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Estrés por calor</td>
			<td>ARNNP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Recuperación</td>
			<td>ARNNP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>ARNPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Contenidos y cualidades de ARN polisomal y no polisomal. En esta tabla se analizaron los contenidos y calidades de ARN. El contenido de ARN se normalizó después de la extracción utilizando métodos modificados.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

translation-efficiency-test-using-polysome-profiles-under-heat-stress

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

En este video se describe un método para evaluar la reacción psicofisiológica persona al estrés utilizando biofeedback. También presentará las directrices generales para la planificación del tratamiento.

Evaluación psicofisiológica de estrés uso de Biofeedback

Aprende a realizar perfiles de polisomas para analizar la eficiencia de traducción en Arabidopsis thaliana bajo estrés térmico. Este protocolo estandarizado utiliza normalización spike-in para estudios translatómicos precisos.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

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