Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

Mi actividad investigadora se centra en comprender los mecanismos que hacen que los macrófagos sean resistentes a la infección por VIH, el virus responsable de la pandemia de sida. En particular, nos centramos en la actividad de la enzima que se llama HT-1 que degrada los NTP, los componentes básicos de los genomas virales. Pero esta enzima también tiene otras actividades que tratamos de dilucidar.

Establecimos un protocolo para modificar genéticamente las células THP1. Estas células son un sustituto bien establecido para que los macrófagos humanos lo estudien. Por ejemplo, la replicación del VIH-1.

Estas células son difíciles de transfectar para manipular su contenido de proteínas. Por lo tanto, establecemos métodos para manipular su genoma utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Desde el diseño de ARNs SG hasta la validación de poblaciones policlonales y monoclonales.

Nuestro protocolo tiene como objetivo lograr la edición de alta eficiencia de un gen de interés en las células THP1 que será electroporado con complejos de ribonucleoproteínas preensamblados por los ARN de energía nucleasa Cas9. En este enfoque, la actividad de Cas9 está limitada en el tiempo. Esto reduce la posibilidad de generar efectos objetivo que a menudo surgen cuando se emplean vectores de lenti.

Y en este caso, efectivamente la expresión de Cas9 está prolongando el tiempo y, por lo tanto, puede ser perjudicial para la célula. Para comenzar, llene cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos con 500 microlitros de medio RPMI 1640 sin antibiótico y suplementado con FBS inactivado y filtrado al 20% de calor. Coloque la placa en una incubadora humidificada durante la noche.

Para rehidratar la guía única seca o los sgRNAs a una concentración final de 100 micromolares, agregue 10 microlitros de tampón TE por un nano mol de sgRNA. Agite la solución en vórtice durante 30 segundos e incube a cuatro grados centígrados durante la noche para garantizar una rehidratación completa. Al día siguiente, para preparar la solución de sgRNA de trabajo de 30 micromolares, primero homogeneice brevemente la solución de sgRNA de stock de 100 micromolares con una pipeta, luego diluya el tallo en agua libre de nucleasas.

Agite la solución durante 30 segundos e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Diluya un microlitro de cada una de las tres soluciones de trabajo de 30 micromolares de sgRNA y 0,5 microlitros de 20 micromolares de solución Cas9 en 3,5 microlitros de tampón de resuspensión R, para ensamblar las ribonucleoproteínas de sgRNA Cas9 agregue una proporción de uno a nueve molares. Agite brevemente e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Para preparar un control sin editar, agregue 0,5 microlitros de 20 micromolares de solución Cas9 a 6,5 microlitros de tampón de resuspensión R.Vortex brevemente e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente, agregue cinco microlitros de tampón de resuspensión R a las muestras para lograr un volumen final de 12 microlitros por condición de electroporación. Para preparar las células THP-1 después del recuento de células, recoja un volumen equivalente a 0,2 veces 10 a la potencia de seis células THP-1 y centrifuérrelas a 336 G durante cinco minutos a 20 grados centígrados, aspire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS. Centrifugar de nuevo y resuspender el pellet celular en los 12 microlitros de solución de ribonucleoproteína.

Para configurar el sistema de electroporación, coloque la estación de pipetas debajo de un gabinete de bioseguridad y coloque un tubo de electroporación dentro del gabinete, agregue tres mililitros de tampón E del kit de electroporación al tubo de electroporación. Encienda el dispositivo de electroporación y use la pantalla táctil para configurar los parámetros de electroporación, voltaje a 1, 500 voltios. Duración a 10 milisegundos.

Y el número a tres. Equipar la pipeta de electroporación con una punta y aspirar 10 microlitros de la solución de ribonucleoproteína THP-1. Inserte la pipeta en el tubo de electroporación y pulse start en la pantalla del dispositivo de electroporación.

Espere a que aparezca el mensaje de completado y retire la pipeta del tubo. Transfiera las células THP-1 a un pocillo de la placa de cultivo precalentada de 24 pocillos y homogeneice suavemente la muestra. Vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada y deje que las células descansen sin ser molestadas durante 72 horas.

Después de la electroporación y el recuento de células, extraiga un volumen equivalente a 0,1 veces 10 a la potencia de seis células THP-1 en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 336 G durante cinco minutos a 20 grados centígrados y aspirar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS. Nuevamente, centrifuga las células, aspira la mayor cantidad posible de sobrenadante sin perturbar el pellet y rompe, congela el pellet.

Para la extracción de ADN genómico, vuelva a suspender el pellet con 50 microlitros de solución de extracción de ADN. Homogeneizarlo y transferir todo el volumen a un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Agite el tubo y centrífugue brevemente durante un pulso de tres segundos.

Coloque el tubo en un termociclador y caliente a 65 grados centígrados durante 15 minutos, seguido de 98 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, diluya el ADN extraído con 90 microlitros de agua ultrapura, vórtice y centrifugue brevemente a 5000 g durante tres segundos. Diluir el cebador de PCR en agua ultrapura hasta una concentración final de 10 micromoles.

Prepare la mezcla de PCR en un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Coloque los tubos de PCR en el termociclador y ejecute el programa con la configuración especificada. Para poblaciones policlonales editadas en un nuevo tubo de 0,2 mililitros.

Mezcle 17,5 microlitros del amplicón de PCR con dos microlitros de tampón E dos para obtener un volumen final de 19,5 microlitros. Agite la solución y centrifugue brevemente, alternativamente, para el cribado de clones de células individuales, mezcle los productos de PCR de las células de control editadas y no editadas en una proporción de uno a uno. Para la formación hetero dúplex, coloque los tubos en un termociclador y ejecute el programa dado.

Después de la formación heterodúplex, agregue 0,5 microlitros de endonucleasa T 7 una solución al tubo e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para preparar las muestras para la electroforesis en gel, mezcle cinco microlitros de los productos de digestión de la endonucleasa T7 o del producto de PCR sin digerir con cinco microlitros de agua y dos microlitros de seis colorantes de carga de ADNx, cargue las muestras y la escala de tamaño en el gel y haga funcionar el gel a 80 voltios durante 45 minutos. La edición génica mediada por CRISPR Cas9 del locus EGFP dio lugar a una fuerte disminución de las células positivas para GFP, alcanzando una reducción de más del 90% al séptimo día después de la electroporación.

Al tercer día después de la electroporación, el número de células se había reducido a la mitad debido al estrés inducido por la electroporación, pero se recuperó por completo al séptimo día en un medio RPMI completo. La endonucleasa T7, por ejemplo, y la electroforesis en gel de Agarose demostraron la pérdida de aproximadamente 75 fragmentos de pares de bases en células editadas, lo que confirma la edición CRISPR del sitio objetivo de EGFP.