Name: Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a visualizar glicoconjugados sialilados intracelulares mediante etiquetado metabólico, química de clic y microscopía de expansión. Este método accesible mejora la resolución espacial sin equipos especializados.

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<meta charset="utf8"></head><body>Microscopía de expansión para la visualización de glicanos sialilados intracelulares mediante MOE

<ol><li>De Souza, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+at+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light microscopy at the limit.</a> Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).</li>
<li>Tam, J., Merino, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29+in+comparison+with+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+and+other+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods.</a> J Neurochem. 135, 643-658 (2015).</li>
<li>Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+STED+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for STED optical nanoscopy.</a> Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543548(2015).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+a+thermally+adjustable+expansion+factor+using+thermoresponsive+biospecimen-hydrogel+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).</li>
<li>Dube, D., Bertozzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+oligosaccharide+engineering+as+a+tool+for+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).</li>
<li>Scache, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+azide+and+alkyne+tags+on+bioorthogonal+reporters+in+metabolic+labeling+of+sialylated+glycoconjugates%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study.</a> Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).</li>
<li>Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+characteristics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glycosylation characteristics of colorectal cancer.</a> Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).</li>
<li>Boyaval, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycomic+signature+of+stage+II+colorectal+cancer+and+its+association+with+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).</li>
<li>Ferreira, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation+in+gastric+and+colorectal+cancers%3A+Toward+cancer+detection+and+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics.</a> Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).</li>
<li>Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+bacteria+utilize+sialic+acid+during+interactions+with+the+host%3A+snip%2C+snatch%2C+dispatch%2C+match+and+attach%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach.</a> Microbiology. 168 (3), 001157(2022).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy%3A+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li>
<li>Vanbeselaere, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkynyl+monosaccharide+analogues+as+a+tool+for+evaluating+Golgi+glycosylation+efficiency%3A+application+to+Congenital+Disorders+of+Glycosylation+%28CDG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG).</a> Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).</li>
<li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+glycomics+enrichment%3A+imaging+the+recycling+of+sialic+acid+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells.</a> J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).</li>
<li>Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+view+your+biomolecule%2C+click+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">To view your biomolecule, click inside the cell.</a> Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cysteine+S-glycosylation+induced+by+per-O-acetylated+unnatural+monosaccharides+during+metabolic+Glycan+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling.</a> Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).</li>
<li>Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glyco-modification+through+an+elimination-addition+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism.</a> J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Huisgen+cycloaddition+process%3A+Copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide%E2%88%92alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).</li>
<li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne-azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).</li>
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<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+Application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).</li>
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<li>Slade, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+CHO+secretome+using+mucin-type+O-linked+glycosylation+and+click-chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry.</a> J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).</li>
<li>Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM).</a> Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+click+chemistry+for+bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation.</a> Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Santiago, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+swelling+behaviour+of+poly%28sodium+acrylate%29%2Fsepiolite+superabsorbent+composites+and+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Polym+Int%22%5BJournal%5D)">Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites.</a> Polym Int. 55 (8), 843848(2006).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+expansion+microscopy%3A+Chemical+strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications.</a> Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).</li>
<li>Drelich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+high+spatially+resolved+proteomics+using+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy.</a> Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+multifunctional+polymer+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with multifunctional polymer dots.</a> Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).</li>
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El protocolo de marcaje actual de CuAAC no incluye aminoguanidina en el tampón de reacción. Dado que está dirigido a visualizar glicoconjugados intracelulares, se realiza en células que se fijan después de la etapa de incorporación metabólica, para evitar cualquier problema de citotoxicidad y mejorar la absorción del sistema catalítico. El uso de aminoguanidina se recomienda típicamente para el marcaje de la superficie celular de células vivas para prevenir reacciones secundarias entre el dehidroascorbato y los residuos ...

La microscopía de fluorescencia, aunque se usa ampliamente para marcar y visualizar moléculas específicas dentro de las células, está inherentemente limitada en resolución por el límite de difracción de la luz1 de Abbe, que restringe la capacidad de distinguir entre objetos más cercanos a aproximadamente 200-250 nm. Esta limitación surge de la naturaleza ondulatoria de la luz y la apertura numérica de la lente del objetivo del microscopio, lo que presenta un desafío al obtener imágenes de estructuras subcelulares. La superación de estas limitaciones proporciona una mejor comprensión de ciertos procesos biológicos a escala nanométrica.
Para superar el límite de difracción de la luz, se han desarrollado técnicas de microscopía de superresolución como STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica) y STED (Agotamiento de Emisiones Estimuladas) 2,3. STORM se basa en la activación estocástica de los fluoróforos, lo que permite obtener imágenes solo de un subconjunto disperso en un momento dado. Esto permite la localización precisa de fluoróforos individuales, lo que permite la reconstrucción de una imagen de alta resolución. STED, por otro lado, mejora la resolución mediante el uso de un láser de agotamiento para apagar selectivamente la fluorescencia alrededor de la periferia del punto de excitación, reduciendo efectivamente la función de dispersión del punto.
Estos enfoques contrastan con la microscopía de campo amplio o confocal, en la que se detectan simultáneamente todos los fluoróforos, lo que da como resultado una imagen que combina todos los patrones de difracción y evita la distinción entre fluoróforos individuales cercanos, lo que lleva a una pérdida de resolución. Sin embargo, estos métodos de superresolución requieren fuentes de luz, equipos, preparación de muestras y/o fluoróforos muy específicos, lo que hace que estas tecnologías sean costosas, de difícil acceso en la mayoría de los laboratorios y difíciles de implementar en experimentos de rutina. Estas limitaciones han llevado a la comunidad científica a buscar soluciones alternativas para lograr una mayor resolución, que sean compatibles con los equipos de microscopía fácilmente disponibles y los protocolos de tinción de rutina. En 2015, Boyden y sus colaboradores desarrollaron un método para eludir las limitaciones de la microscopía óptica mediante la expansión física de la muestra, llamado Microscopía de Expansión (ExM)4.
ExM es un método de tres pasos que proporciona detalles a nanoescala de muestras biológicas sin superar el límite de difracción de la luz (Figura 1). En su lugar, utiliza microscopios convencionales limitados por difracción para obtener imágenes de muestras que se han ampliado físicamente de forma isotrópica. El primer paso, llamado gelificación, consiste en incrustar la muestra biológica, generalmente células o tejidos fijos, en un hidrogel de polielectrolito hinchable a base de acrilato de sodio y acrilamida. A continuación, la muestra biológica se somete a un tratamiento enzimático para degradar parcialmente ciertos componentes, como proteínas o membranas, y descomponer las estructuras celulares densas para garantizar que las células puedan expandirse uniformemente. Este paso, llamado digestión, ayuda a lograr esto al homogeneizar los componentes estructurales de la muestra con respecto a las propiedades mecánicas, evitando la expansión diferencial que podría conducir a la distorsión de la muestra. Finalmente, en el último paso, llamado expansión, la muestra incorporada en hidrogel y digerida se coloca en agua desionizada, lo que hace que se hinche. Esta tecnología da como resultado que la muestra se expanda en un factor de aumento lineal de aproximadamente 4-5x en cada dimensión, lo que permite la visualización de detalles celulares finos utilizando técnicas de microscopía estándar. Dada la naturaleza isotrópica de la expansión, la muestra biológica ampliada dentro de la matriz de gel conserva sus detalles geométricos tridimensionales y las relaciones espaciales entre sus diversos componentes estructurales. Por lo tanto, la información espacial se conserva al hincharse, mientras que la distancia entre las etiquetas fluorescentes ancladas en gel o las biomoléculas aumenta uniformemente en todas las direcciones. Esto permite una mejor separación de las señales, lo que da como resultado una resolución mejorada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig01.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del Protocolo ExM. (a) Gelificación: La muestra biológica está anclada e incrustada dentro de un hidrogel de polielectrolito hinchable. b) Digestión: Las propiedades mecánicas de la muestra se homogeneizan mediante el uso de enzimas y detergentes, descomponiendo las proteínas y las membranas lipídicas que, de otro modo, restringirían la expansión y crearían distorsiones. (c) Expansión: El hidrogel se sumerge en agua desionizada, lo que hace que se expanda isotrópicamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Desde 2015, ExM ha experimentado importantes mejoras tecnológicas en la preservación de la información espacial. En particular, se han diseñado varios anclajes moleculares para unir covalentemente biomoléculas directamente al hidrogelhinchable 5,6. En este protocolo, utilizamos N-acriloxisuccinimida (NAS), que reacciona con los grupos amina libres de las biomoléculas (típicamente, residuos de lisina o posiciones N-terminales de las proteínas) para bioconjugar un grupo acriloilo con las proteínas de la célula, incluidas las glicoproteínas. Este grupo acriloilo reacciona con otros monómeros a través de reacciones de reticulación durante la gelificación, anclando estas biomoléculas directamente al polímero.
ExM es compatible con una amplia gama de métodos de etiquetado, incluida la ingeniería de oligosacáridos metabólicos (MOE). El MOE es una poderosa herramienta que permite el marcaje de glicanos mediante la incorporación de análogos de precursores metabólicos dotados de un mango químico bioortogonal7. Estos análogos, conocidos como reporteros químicos, se integran en las vías metabólicas sin causar toxicidad. En el enfoque MOE, los monosacáridos reporteros se procesan metabólicamente en azúcares nucleótidos activados y luego se transfieren a glicoconjugados nacientes. Nuestro enfoque principal se centra en el estudio de la sialilación, en particular la dinámica intracelular y el tráfico de N-glicoproteínas sialiladas, que es crucial en el contexto de la salud y la enfermedad debido a su papel en las interacciones célula-célula, la regulación inmunitaria y el desarrollo. La sialilación anormal está implicada en enfermedades como el cáncer 8,9,10,11, las enfermedades infecciosas12 y los trastornos genéticos 13,14,15, lo que la convierte en un objetivo clave para el desarrollo terapéutico y el descubrimiento de biomarcadores. La comprensión de la sialilación mejora los conocimientos sobre la glicobiología y los mecanismos de la enfermedad.
La sialilación puede ser probada usando MOE con análogos del ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), el ácido siálico más abundante en los seres humanos, o con análogos de la N-acetilmannosamina (ManNAc), un precursor metabólico de Neu5Ac, con un mango bioortogonal 8,16. El ManNAc se convierte en Neu5Ac en el citosol, y luego se activa en ácido citidina-5′-monofosfo-N-neuramínico (CMP-Neu5Ac) en el núcleo. Una vez activadas en un azúcar nucleótido, las sialiltransferasas en el aparato de Golgi transfieren unidades Neu5Ac a las posiciones terminales de las cadenas de glicanos en crecimiento (Figura 2). Tras la incorporación metabólica de derivados no naturales del ManNAc, los glicanos sialilados marcados pueden unirse covalentemente a un fluoróforo que contiene un grupo reactivo complementario al mango reportero mediante química de clic bioortogonal. Esto permite la observación directa de glicoconjugados in vivo o ex vivo.
Para la mayoría de los reporteros de monosacáridos, se requiere una forma peracetilada para atravesar la membrana plasmática a través de la difusión pasiva. Sin embargo, se ha demostrado que tanto los reporteros peracetilados como los no protegidos sondean eficientemente la sialilación16. Los reporteros de sialilación no protegidos son capaces de entrar en las células mediante mecanismos de transporte activos, a saber, la pinocitosis para los análogos de Neu5Ac y un transportador aún no identificado para ManNAc. Si bien los azúcares sin protección requieren una concentración más alta (generalmente 100-500 μM) para lograr efectos comparables, una vez dentro de la célula, pueden ingresar directamente a la ruta metabólica del ácido siálico. Por el contrario, los azúcares peracetilados necesitan ser completamente desacetilados por esterasas intracelulares no específicas antes de volverse metabólicamente activos. Aunque se pueden usar en concentraciones más bajas (generalmente 10-50 μM), la desacetilación incompleta puede interferir con la actividad enzimática o conducir a la incorporación de análogos de ácido siálico parcialmente acetilados, lo que podría sesgar el análisis posterior. Además, la liberación de ácido acético puede afectar el pH localmente, lo que puede afectar la función celular. Chen y sus colegas también han demostrado que los azúcares per-O-acetilados reaccionan con los residuos de cisteína libre en las proteínas a través de un mecanismo no enzimático, lo que lleva a la incorporación fuera del objetivo y al aumento de la señal inespecífica17,18. Por lo tanto, en el presente protocolo, empleamos reporteros ManNAc no protegidos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig02.jpg"> 
Figura 2: Ingeniería metabólica de oligosacáridos y marcaje de ácidos siálicos. UDP-GlcNAc se convierte en ManNAc por el dominio UDP-GlcNAc 2-epimerasa de GNE/MNK en el citosol. A continuación, el ManNAc es fosforilado en el citosol por el dominio ManNAc 6-quinasa de GNE/MNK para formar ManNAc-6-fosfato. La N-acetilneuraminato sintasa cataliza la condensación de ManNAc-6-P con fosfoenolpiruvato para producir Neu5Ac-9-fosfato, que posteriormente es desfosforilado por la fosfatasa del ácido siálico para producir Neu5Ac. Neu5Ac también puede ser suministrado por la vía de rescate a través de la endocitosis y el reciclaje lisosomal8. Después del transporte al núcleo, se convierte en CMP-Neu5Ac por la CMP-ácido siálico sintetasa. En el aparato de Golgi, CMP-NeuAc es el sustrato de las sialiltransferasas que introducen una fracción de Neu5Ac en las posiciones terminales de los glicanos en los glicoconjugados en maduración, que finalmente se expresan en la membrana celular o se secretan. Los reporteros químicos ManNAz con un mango bioortogonal pueden penetrar en la célula a través de un transportador activo no identificado e ingresar a la vía metabólica. Las unidades Neu5Az marcadas incorporadas en los glicanos después de la biosíntesis se marcan a través de la conjugación mediada por CuAAC de una sonda fluorescente. Abreviaturas: NAc = N-acetilo; UDP-GlcNAc = Difosfato de uridina N-acetilglucosamina; ManNAc = N-acetilmannosamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerasa; MNK = ManNAc 6-quinasa; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfato; NANS = N-acetilneuraminato sintasa; PEP = fosfoenolpiruvato; Neu5Ac = ácido N-acetilneuramínico; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfato; NANP = fosfatasa de ácido siálico; CMP = citidina-5′-monofosfato; CMAS = CMP-ácido siálico sintetasa; STs = sialiltransferasas; ManNAz = N-azidoacetilmannosamina; Neu5Az = Ácido N-azidoacetilneuramínico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67479/67479fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Entre las posibles reacciones bioortogonales, centramos nuestro interés en la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC)16,19. Según nuestra experiencia, el CuAAC es la mejor opción para el marcaje de glicanos intracelulares en células fijas. Esta reacción está bien establecida, se ha estudiado a fondo en química bioortogonal y se ha estandarizado para su uso en entornos biológicos complejos, lo que proporciona una base sólida de conocimientos y protocolos optimizados. De hecho, su cinética rápida ofrece una alta eficiencia de reacción y especificidad, e involucra grupos azida y alquino que son fáciles de sintetizar, estables, ausentes de los sistemas vivos e inertes a las biomoléculas nativas, lo que lo hace ideal para aplicaciones de celdas fijas donde la toxicidad del cobre no es un problema. La cicloadición de alquina-azida (SPAAC) promovida por cepa20,21, si bien evita la toxicidad del cobre, tiene una cinética más lenta y sondas más voluminosas, lo que tiende a conducir a una señal de fondo más alta y una disminución de la relación señal-ruido para aplicaciones intracelulares debido al atrapamiento hidrofóbico, mientras que la demanda inversa de electrones Diels-Alder (IEDDA)22,23, aunque rápido y sin cobre, implica una síntesis de sonda más compleja y requiere grupos reporteros más voluminosos que aún no se han caracterizado completamente en aplicaciones de MOE. Dado que ExM requiere exclusivamente células fijas, CuAAC ofrece una solución robusta y eficiente para el etiquetado bioortogonal.
En este trabajo se presenta un protocolo para la visualización de glicoproteínas sialiladas intracelulares en células, combinando marcaje metabólico, química de clic bioortogonal y microscopía de expansión. En los procedimientos experimentales descritos en este trabajo, utilizamos N-azidoacetilmannosamina (ManNAz) como reportero químico, y la ligadura de CuAAC de pequeños fluoróforos orgánicos se realiza antes del procedimiento de expansión. Las glicoproteínas se anclan al hidrogel con NAS antes de la gelificación, la digestión y la expansión. El marcaje MOE de los ácidos siálicos puede asociarse con enfoques de inmunofluorescencia para la evaluación de la colocalización, como se ejemplifica aquí con un anticuerpo primario anti-GM130 de ratón localizado en el aparato cis-Golgi. Este protocolo se puede aplicar a células en su estado fisiológico, o a células que han sido sometidas a tratamiento químico. Para ilustrar esto, la cloroquina se utilizó para inhibir la función lisosomal, que afecta el procesamiento y el tráfico de glicoproteínas dentro de las células. La tinción nuclear se utiliza como punto de referencia, no solo para localizar células, sino también como indicador de la calidad del proceso ExM. De hecho, el factor de expansión se puede medir comparando el tamaño del núcleo antes de la expansión (preExM) y la postexpansión (postExM).

<table><tbody><tr><td>(+) L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico N-hidroxisuccinimida éster&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 alkyne&nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1277-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9913</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Acrilamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BTTAA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-067-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrifugación 2 mL</td><td>EPPENDORF</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Sal de difosfato de cloroquina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 15 mL</td><td>Cubreobjetos de 352097</td><td></td><td></td>Falcon</tr><tr><td>12 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00120RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos 32 mm #1</td><td>epredia</td><td>CB00320RA140MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio de alta glucosa&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0104-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasto 533T</td><td>-</td><td>-</td><td>Recogido de individuos sanos</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.9.0</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Bio-RAD</td><td>170-6537</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50950</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.2</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Euromedex</td><td>PB0447-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía confocal anhidra LSM 780&nbsp;</td><td>Zeiss-MCF7</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilmannosamina (ManNAc)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA05269</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td></td></tr><tr><td>N-azidoacetilmannosamina (ManNAz)</td><td>BIOSYNTH</td><td>MA46002</td><td></td></tr><tr><td>Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Aceite DIC M27</td><td>Zeiss</td><td>420782-9900-799&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>de&nbsp; Tritirachium álbum</td></tr><tr><td>purificado ratón GM130 anticuerpo</td><td>BD Bioscience</td><td>610822</td><td>50 y micro; g</td></tr><tr><td>Acrilato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>T75 Frasco</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>tris Acetato EDTA (TAE) 10x</td><td>Euromedex</td><td>EU0202-B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Azul</td><td>Dutscher</td><td>702630</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 1x</td><td>Dutscher</td><td>L0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

A continuación se muestra la aplicación del protocolo para visualizar glicoproteínas siadiladas en células HeLa (Figura 3A) y células MCF7 (Figura 3B), omitiendo el tratamiento con CQ (sección 2 del protocolo) y la tinción de colocalización con inmunofluorescencia (paso 5.3 del protocolo).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67479/67479fig03.jpg"> 
<strong class="xfi...

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

visualizing-intracellular-sialylation-with-click-chemistry-expansion

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Neisseria meningitidis (Nm), una gram negativos humanos específicos de patógenos respiratorios, se puede unir a humanos α-actinina. Aquí se presenta un protocolo para la visualización de la colocalización de la bacteria intracelular de α-actinina después de la entrada de bacterias en las células endoteliales microvasculares cerebrales (HBMECs).

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Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa: un método robusto para la cuantificación de ácidos siálicos marcados y derivatizados con fluorescencia aislados de hígado de ratón

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Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

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La comunicación entre celulares es fundamental para el control de diversas actividades fisiológicas dentro y fuera de la célula. En este trabajo se describe un protocolo para la medición de la naturaleza espacio-temporal de las secreciones de células individuales. Para ello, se utiliza un enfoque multidisciplinario que integra nanoplasmonic etiqueta libre de detección con imágenes de células vivas.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Ácido siálico es una típica unidad de monosacárido encontrada en glicoconjugados. Participa en una gran cantidad de interacciones moleculares y celulares. Aquí presentamos un método para modificar la expresión de superficie ácido siálico celular con glycoengineering metabólico derivados de N- acetylmannosamine.

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Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

El estudio de la acilación grasa tiene importantes implicaciones en las interacciones y enfermedades de las proteínas celulares. Aquí se presenta un protocolo modificado para mejorar la detección química de clics de proteínas aciladas grasas, que se puede aplicar en varios tipos de células y combinarse con otros ensayos, incluida la persecución de pulsos y la espectrometría de masas.

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.

Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

Se presenta un protocolo único y completo para generar células dendríticas derivadas de monocitos humanos desialiladas (mo-DC) a partir de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) utilizando un tratamiento con siaridasa. Además, se describen métodos para evaluar la caracterización fenotípica y funcional de las mo-DC y evaluar cómo el tratamiento con sialidasa mejora el nivel de maduración de las mo-DC.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes fenotipos sialilados

Aprende a visualizar glicoconjugados sialilados intracelulares mediante etiquetado metabólico, química de clic y microscopía de expansión. Este método accesible mejora la resolución espacial sin equipos especializados.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

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