Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

La reparación del cartílago en la enfermedad articular crónica exige terapias avanzadas basadas en células para regenerar los tejidos dañados de manera eficiente. Este protocolo proporciona un método paso a paso para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en esferoides basados en condrocitos, lo que respalda las aplicaciones de ingeniería de tejidos y terapia celular. La reparación del cartílago en la enfermedad articular crónica exige terapias avanzadas basadas en células para regenerar suficientemente el tejido dañado.

Este protocolo proporciona un método paso a paso para diferenciar células madre pluripotentes inducidas en esferoides basados en condrocitos, lo que respalda las aplicaciones de ingeniería de tejidos y terapia celular. Los principales desafíos son minimizar la expresión de colágeno tipo uno en las células derivadas de iPSC para prevenir el cartílago fibroso, crear condiciones para la formación madura de cartílago alto, mejorar los métodos de cultivo 3D para la estabilidad de los esferoides y desarrollar enfoques escalables para producir volúmenes clínicos de material celular. El protocolo proporciona una ventaja al utilizar iPSC como fuente alternativa de condrocitos, lo que permite una producción escalable sin procedimientos invasivos.

Garantiza un mejor mantenimiento del fenotipo de los condrocitos a través del cultivo en 3D e imita el desarrollo natural del cartílago, lo que da como resultado células muy parecidas a los condrocitos nativos con una alta expresión de marcadores específicos del cartílago. Desarrollar métodos eficaces para mejorar la madurez y la funcionalidad de los condrocitos derivados de iPSC, garantizar la estabilidad a largo plazo in vivo, crear materiales de cultivo tridimensionales fibrosados y desarrollar la producción escalable de material celular para su aplicación clínica. Para comenzar, esterilice las tijeras en un autoclave configurado a 121 grados Celsius a 15 libras por pulgada cuadrada durante 30 minutos.

Después de que las tijeras se sequen, corte los tubos de centrífuga en anillos de siete a ocho milímetros de altura. Ahora triture las placas de Petri de baja adherencia, sin tratar o microbiológicas en trozos pequeños con una herramienta de trituración adecuada. Disuelva aproximadamente un gramo de partículas de plástico en 10 mililitros de cloroformo durante la noche dentro de una campana extractora.

Verifique la viscosidad de la solución de plástico líquido para asegurarse de que sea adecuada para el pipeteo. Si la solución es demasiado delgada, agregue de uno a tres gramos de partículas de plástico adicionales. Si se vuelve demasiado espeso, dilúyelo con unos cinco mililitros de cloroformo.

Coloque un anillo de plástico de autoclave en el centro de una placa de Petri de 60 milímetros. Luego aplique plástico líquido dentro del anillo para formar una perilla de plástico. Deje que los platos se sequen sin tapar en una campana de flujo laminar durante dos o tres horas.

Después del secado, exponga los platos a la radiación ultravioleta durante 20 a 30 minutos. Para comenzar, obtenga las placas de Petri modificadas que contienen perillas de plástico. Dos días después de la recolección de cartílago, lave las piezas de cartílago en la solución de Hank con placas de Petri de 60 milímetros.

A continuación, corte el cartílago en fragmentos de aproximadamente uno o dos milímetros de diámetro con unas tijeras de autoclave. Transfiera las piezas de cartílago a un tubo de 15 mililitros y digiera en una solución de colagenasa tipo dos al 0,01% en DMEM durante ocho a 12 horas en una incubadora agitadora orbital. Después de la digestión, agregue los fragmentos de cartílago con DMEM y centrifugue el tubo a 300 G durante 10 minutos.

Después de desechar la solución de lavado, vuelva a suspender los fragmentos en un medio de cultivo de condrocitos y siembróguelos en un matraz adhesivo T25 prerrecubierto con una solución de gelatina al 0,1% e incube. A continuación, cultive células madre pluripotentes inducidas en placas de seis pocillos prerrecubiertas con una matriz que contenga proteínas extracelulares. Para iniciar la diferenciación hacia el linaje condrocítico, se cultivan iPSCs en medio A durante los dos primeros días.

En el tercer día, reemplace el medio A con una solución que excluya CHIR-99021 y el inhibidor de la rho-quinasa, manteniendo todos los demás componentes sin cambios. En el día 10, transfiera las células similares a los condrocitos al medio B formulado para facilitar la condrogénesis, luego derrita la argarosa al 1,5% en un microondas durante unos 60 a 90 segundos a 700 vatios. Una vez licuada, agregue 75 microlitros de agarosa a cada pocillo de una placa de cultivo en suspensión celular de 96 pocillos y deje que se endurezca a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 150 microlitros de DMEM a cada pocillo e incube la placa en una incubadora de dióxido de carbono durante al menos 12 horas. En el día 12, observe los cambios fenotípicos asociados con la androgénesis para proceder a la iniciación de los esferoides. Separe las células al 80% de confluencia de la placa utilizando una solución de tripsina al 0,05%.

Después de agregar volúmenes iguales de DMEM con 10% de FBS, transfiera las celdas a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 200 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en un mililitro de medio B y transfiéralas a un matraz de cultivo celular de 75 centímetros cuadrados previamente recubierto con una solución de gelatina al 0,1%. Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia como monocapa, separarlas de nuevo con tripsina y resususpenderlas en el medio B. Ahora dispense las células en una placa de 96 pocillos recubierta con 1,5% de agarosa a una densidad de 100.000 células por pocillo, junto con 150 microlitros de medio B. Incubar las células durante un mínimo de un día y un máximo de tres días hasta que se formen esferoides.

A continuación, transfiera los esferoides de los pocillos utilizando una punta de pipeta de un mililitro con un extremo recortado a un tubo de 15 mililitros. Deje que los esferoides se asienten durante dos o tres minutos y retire el sobrenadante. Ahora sumerja los esferoides en una solución de matriz de membrana basal sin diluir recién descongelada y templada a cuatro grados centígrados.

Después de 30 minutos, centrifugar el tubo a 100 G durante un minuto para recoger los esferoides. Finalmente, transfiera los esferoides a los mini biorreactores preparados y agregue seis mililitros de medio B. Coloque el mini biorreactor dentro de una incubadora de dióxido de carbono. Después de 19 días de diferenciación, el 99% de las células expresaron marcadores condrogénicos agrecano, colágeno tipo uno, colágeno tipo dos y SOX9.

Las condrosferas de alta calidad se identificaron como aquellas con al menos un 90 a 95% de expresión de marcadores génicos condrocíticos, evaluados mediante análisis de expresión génica en el día 30 de diferenciación. Los esferoides maduros exhibieron una morfogénesis consistente, creciendo hasta un diámetro típico de uno a dos milímetros después de dos meses, con esferoides más grandes mostrando zonas centrales con cavidades o necrosis.