Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

Nuestro laboratorio está interesado en comprender cómo la dinámica del pH intracelular modula los comportamientos celulares. Estamos interesados en los comportamientos que contribuyen a la progresión del cáncer porque sabemos que el pH intracelular aumenta en la mayoría de los cánceres. Hacemos mucha microscopía y desarrollamos protocolos para cuantificar los datos de estas imágenes.

Estamos aprendiendo más sobre las vías y procesos celulares que están regulados por el pH. La mayoría de las líneas celulares cancerosas tienen un pH intracelular más alto y muchas muestran mayores niveles de autofagia, pero no sabíamos que esto estaba relacionado. Recientemente demostramos que un pH intracelular más alto en células genéticamente normales es suficiente para aumentar la autofagia.

Nuestro laboratorio es uno de los pocos laboratorios que estudia cómo el pH intracelular o PHI regula el comportamiento celular en un modelo animal completo. Hemos descubierto que el aumento de la PHI promueve una mayor proliferación celular, una migración celular invasiva y la desorganización de los tejidos. Más recientemente, descubrimos que una PHI más alta promueve la autofagia, que es una forma de canibalismo celular.

Estamos abordando la brecha creada por el alto costo y la complejidad de la preparación de muestras para SEM, lo que limita su accesibilidad para muchos laboratorios. En la Universidad Estatal de San José, carecemos de los recursos para SEM. Así que desarrollamos un protocolo más accesible y asequible que nos permite capturar las imágenes de alta resolución sin la necesidad de equipos costosos.

Este protocolo combina técnicas tradicionales utilizadas en entomología y ofrece una alternativa rentable y fácil de usar a la microscopía electrónica de barrido. Se puede adaptar fácilmente para capturar imágenes de alta resolución de diferentes partes de la mosca o diferentes especímenes. Para comenzar, seleccione la cepa de drosophila deseada y colóquela en un vial que contenga alimento para moscas.

Incubar el vial a 25 grados centígrados hasta que las moscas hayan crecido y los adultos estén cerca. A continuación, anestesia a las moscas adultas con dióxido de carbono y colócalas sobre una almohadilla de dióxido de carbono. Prepare un clasificador de moscas de plumas recortando una pluma de ganso para que quepa en el extremo cónico de una pipeta serológica de un mililitro.

Clasifique las moscas con una pluma y seleccione los individuos con alas rectas. A continuación, añada un mililitro de etanol al 70% en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Transfiera las moscas seleccionadas al tubo y colóquelo en hielo.

Usando un punzón de punta especializado. Corta pequeñas puntas triangulares de cartulina de archivo de 65 libras. A continuación, utilice las pinzas de punta fina número cinco de Dumont para doblar la punta de cada punta en un ángulo de 90 grados.

Retire las moscas del tubo de la microcentrífuga con pinzas de punta fina Dumont número cinco. Seque suavemente las moscas con un pañuelo sin pelusa para eliminar el exceso de etanol. Coloque cada mosca en su lado izquierdo en una tarjeta de índice bajo un microscopio de disección.

Con una pipeta de transferencia, mezcle una o dos gotas de pegamento para pieles con una o dos gotas de agua desionizada en una ficha. Toma una punta de tarjeta preparada en el extremo ancho con pinzas y frota la punta doblada en la mezcla de agua y pegamento para aplicar una pequeña cantidad de pegamento. Aplique la punta doblada de la punta de la tarjeta en el lado anterior del abdomen derecho de la mosca alrededor de los segmentos abdominales dos y tres.

Antes de que el pegamento se seque, ajusta la mosca de modo que su eje anterior posterior quede perpendicular a la punta doblada de la punta de la tarjeta. Inserte un pasador de montaje número tres en el extremo ancho de la punta de la tarjeta y asegúrelo a un bloque de clavijas para insectos. Etiquete cada alfiler o fila de alfileres con el genotipo correspondiente.

Para adquirir fotografías de alta resolución de los ojos de Drosophila montados en puntos, encienda el sistema de imágenes de apilamiento. A continuación, configure un cuerpo de cámara DSLR con un teleobjetivo de 70 a 200 milímetros conectado a un objetivo de microscopio Apo de 20x a través de un adaptador de objetivo de 77 milímetros. Asegúrese de que la muestra esté iluminada con un destello a través de un difusor.

Controle la posición Z de la cámara mediante un controlador StackShot y un raíl macro. Coloque la mosca montada en punta en el cardán de escenario universal con el ojo mirando hacia la lente. Ajuste la posición de la cabeza, utilizando cuidadosamente las pinzas para una alineación óptima.

Conecte la cámara a una computadora portátil y ajuste la configuración de adquisición. Ajusta el aumento a 20x, la velocidad de obturación, 1/200 de segundo, la apertura f/2.8 e ISO 400. A continuación, establezca la ubicación para guardar la pila de imágenes resultante en la carpeta de archivos deseada.

Ahora, ajuste la configuración de la pila de enfoque en la unidad de control StackShot en el modo de distancia automática. Establezca el tamaño del paso en cinco micrómetros y calcule el número de pasos estableciendo las posiciones de inicio y parada de la pila de enfoque. Visualice el espécimen en modo de visualización en directo con la cámara en modo de disparo automático.

Mueva el riel de modo que la parte más cercana de la muestra esté enfocada. A continuación, desplácese a la entidad más lejana de interés y ajuste el foco. Vuelva a colocar la cámara en el modo de disparo manual e inicie la adquisición de imágenes desde la unidad de control StackShot.

Después de la creación de imágenes, abra los archivos de imagen adquiridos en el software de apilamiento de enfoque al que se hace referencia. Seleccione Apilar y, a continuación, alinear y apilar todo o Pmax para generar una imagen apilada. A continuación, haga clic en Archivo y guarde la imagen de salida para guardar la imagen apilada final como un archivo tif.

Después de obtener imágenes de los ojos de Drosophila montados en un alfiler, seleccione la imagen apilada para el análisis en la que el ojo esté centrado y alineado con una iluminación adecuada y un desenfoque periférico mínimo. Abra la imagen de la barra de escala de 500 micrómetros en el software Fiji. Mida la longitud de la barra de escala con la herramienta de línea recta.

Haga clic en Analizar y medir para registrar la distancia en píxeles, que corresponde a 500 micrómetros. A continuación, calcule los píxeles por micra y utilícelos para convertir las mediciones de píxeles en medidas micrométricas. Abra el archivo de imagen apilado en Fiyi.

Seleccione lupa en la barra de herramientas para ampliar el área de enfoque. Llena la pantalla con el ojo y la cutícula circundante de la cabeza. A continuación, en la barra de herramientas, seleccione la herramienta de selección a mano alzada y delinee el área de la retina siguiendo la fila más externa de omatidios.

Para eliminar parte de la selección, mantenga presionado el botón de opción y seleccione los píxeles que desea eliminar. Para agregar a la selección, mantenga presionados los botones de opción y cambio y seleccione los píxeles que desea agregar. Para calcular el área, seleccione Analizar y medir.

Una nueva ventana mostrará los parámetros de área, media, mínimo y máximo. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo para documentarlos y convertirlos de píxeles a micrómetros. La sobreexpresión de DNhe2 en moscas GMR-DNhe2 resultó en ojos adultos significativamente más pequeños en comparación con las moscas adultas de tipo salvaje.

Las moscas GMR-DNhe2 mostraron una reducción del 41% en el área ocular en comparación con las moscas de tipo salvaje y una reducción del 48% en comparación con GMRGAL4 moscas heterocigóticas. El tamaño del ojo se restauró en moscas GMR-DNhe2 heterocigóticas para el alelo 3 de Atg1, llevándolo a 129,9 micrómetros cuadrados desde 74,28 micrómetros cuadrados.