Sistemas de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro

Las biopelículas de la plataforma dental están compuestas por cientos de microorganismos que pueden provocar inflamación en su epitelio oral, lo que provoca enfermedades como la gingivitis. Queremos comprender mejor estas interacciones, utilizando modelos de tejidos organotípicos. Estos sistemas proporcionan plataformas útiles para evaluar modalidades de tratamiento alternativas de manera controlada.

Por lo tanto, el avance de las tecnologías de secuenciación en los últimos años está transformando el campo de la biología de las infecciones. Estas tecnologías nos permiten investigar realmente las interacciones entre el huésped y el patógeno, utilizando múltiples técnicas OMICs a través de la evaluación de las firmas del huésped y microbianas a nivel proteómico, transcriptómico y metabolómico. Nuestra investigación reciente ha puesto de manifiesto la importancia de las interacciones entre reinos y polimicrobianas en las infecciones relacionadas con el biofilm.

A través del uso de sistemas de modelos in vitro, hemos podido investigar las interacciones de la biopelícula del huésped, probar nuevas terapias anti-biopelícula y perfilar las comunidades microbianas, utilizando tecnologías innovadoras como RAM y espectroscopia. Los estudios futuros, utilizando estos modelos de tejido organotípico, tendrán como objetivo lograr una firma y un perfil multi-OMIC del microorganismo y el tejido y el cultivo del huésped, juntos. Esperamos descubrir y desentrañar interacciones complejas entre el huésped y bacterias y especies fúngicas específicas en nuestros modelos de biopelícula.

Para comenzar, retire los tallos congelados de las cuentas porosas que contienen especies de estreptococos a 80 grados centígrados. Revive las especies de estreptococos en las placas base de la barrena de sangre Columbia, que contienen un 5% de sangre de caballo desfibrinada estéril. Incubar las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

Al día siguiente, transfiera de tres a cuatro colonias del plato a 10 mililitros de caldo de soja y triptona medio. Cultivar el caldo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 16 a 18 horas. Después de la incubación, centrifugar las suspensiones celulares a 3.000 G durante cinco minutos a 20 grados centígrados.

Lave los pellets celulares con 10 mililitros de PBS estéril. Vuelva a suspender los gránulos en 10 mililitros de PBS y estandarice la suspensión de cada especie de estreptococo, individualmente, utilizando un espectrofotómetro ajustado a 550 nanómetros. Después de la estandarización, diluya cada suspensión de estreptococo, de uno a 10, para alcanzar una concentración de uno por 10 a la potencia de siete células por mililitro en una mezcla uno a uno de caldo Todd Hewitt y medio del Roswell Park Memorial Institute.

Pipetear 500 microlitros de suspensiones celulares diluidas en una placa de microtitulación de 24 pocillos, que contiene un disco de hidroxiapatita de 13 milímetros. Incubar el cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitir la formación de biopelícula. De manera similar, cultivo de microorganismos anaeróbicos en una base de barrena anaeróbica fastidiosa, que contiene un 5% de sangre de caballo estéril desfibrinada.

Estandarizar cada microorganismo anaeróbico a una absorbancia específica y diluirlos en una mezcla uno a uno de caldo Todd Hewitt y medio del Roswell Park Memorial Institute. Después de la maduración de la biopelícula de estreptococos, retire con cuidado las células no adheridas y los medios gastados de los pocillos. Agregue 500 microlitros de suspensión estandarizada de uno por 10 a la potencia de siete celdas por mililitro de cuatro microorganismos anaeróbicos en cada pocillo.

Incubar las biopelículas durante 24 horas en condiciones anaeróbicas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, retire las células no adheridas y los medios usados de los pozos. Agregue 500 microlitros de una mezcla estéril uno a uno de caldo Todd Hewitt y medio del Roswell Park Memorial Institute.

Cultivo de los biofilms en condiciones anaeróbicas durante 24 horas. Al séptimo día, lavar las biopelículas dos veces con 500 microlitros de PBS estéril para el cocultivo. Para comenzar, desempaque y transfiera el epitelio oral humano o el tejido y los medios HOE a un gabinete de seguridad de clase dos.

Agregue un mililitro del medio de mantenimiento suministrado con el pañuelo a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Con pinzas estériles, retire los insertos de policarbonato que contienen el tejido HOE de la barrena de nutrientes y la placa de envío de 24 pocillos. Transfiera el tejido a la placa de 12 pocillos preparada.

Incubar los modelos de tejido durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para aclimatarlos a las condiciones de laboratorio. Mientras tanto, para eliminar las biopelículas de los discos de hidroxiapatita, use una aguja de calibre 19 y pinzas para levantar los discos desde la parte inferior de la placa de 24 pocillos. Transfiera los discos a una joya que contenga un mililitro de DPBS estéril.

Sonicar los discos a 35 kilohercios durante 10 minutos en un baño de agua de sonicación. Después de la aclimatación, use pinzas para quitar los insertos de tejido de la placa de 12 pocillos. Pipetear 100 microlitros de la suspensión de sonicate de biofilm directamente sobre los modelos de tejido.

Transfiera los insertos a otra placa de 12 pocillos que contenga un mililitro de medios de mantenimiento nuevos. Incubar los modelos de tejido durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para el procesamiento de tejidos, prepare 350 microlitros de tampón de lisis RLT, que contiene un 1% de mercaptoetanol en un tubo de junta tórica con tapón de rosca de dos mililitros.

Agregue aproximadamente 100 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido de 0,5 milímetros al tubo. Con unas pinzas, retire los insertos que contienen el tejido del medio y deseche cualquier suspensión microbiana restante del inserto. Sostenga el inserto invertido a la altura de los ojos, luego use una aguja de calibre 19 para cortar cuidadosamente el tejido y la membrana desde la parte inferior del inserto.

Transfiera el tejido y la membrana al tampón RLT preparado. Homogeneice el tejido durante 30 segundos, utilizando un homogeneizador de cuentas de sobremesa. Extraiga el ARN del lisado resultante, siguiendo las instrucciones del kit de extracción de ARN del fabricante.

Recoja los medios de tejido gastados restantes para análisis proteómicos, utilizando metodologías de bajo y alto rendimiento. La expresión génica de los biomarcadores inflamatorios en el tejido HOE se reguló significativamente después de la exposición al sonicato de biopelícula, en comparación con el control no estimulado. Los mayores cambios en el pliegue se observaron para CCL2, CXCL1 y CSF3.

La expresión de ARNm de IL8 en el tejido HOE se incrementó 8,67 veces, tras la estimulación con sonicato de biopelícula, en comparación con el tejido controlado. Los niveles de proteína IL8 en los medios gastados se incrementaron de 1,005 nanogramos por mililitro en el tejido de control a 4,245 nanogramos por mililitro en el tejido estimulado por sonicateto de biopelícula.