Name: Optimización de la reacción de transcripción in vitro para la producción de ARNm mediante la monitorización cromatográfica en línea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a optimizar la transcripción in vitro de ARNm mediante cromatografía en línea para maximizar el rendimiento y reducir costos. Este método permite monitorear en tiempo real el consumo de NTPs y la producción de ARNm con alta eficiencia.

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<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
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<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
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<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m Filtro de membrana PES, p. ej. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>tubos de plástico de 0,5 mL; p. ej., p. ej., DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>tubos de plástico de 1,5 mL; p. ej., DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Refrigerador de sobremesa -20 &° </td><td>Columna</td><td></td> analítica CIMac PrimaS de 0,1 mL de la marca C 114935 <td></td></tr><tr><td>(2 &micro; m)</td> <td>Separaciones Sartorius BIA</td><td>110.5118-2, 2 y micro; Solución</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>p. ej. 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>Solución GTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vial de alta recuperación</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>mRNA standard, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA Separaciones</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>plataforma analítica de ARNm PATfix&nbsp;</td><td>Sartorius BIA Separaciones</td><td>PAT0021</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 100 &ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referencia 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 2 &ndash; 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referencia 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20 &ndash; 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referencia 2</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfatasa</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Reactivo de descontaminación</td><td>Thermo Scientic 10328011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inhibidor de la ARNasa</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARNm polimerasa</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>UTP Solución</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Tapones de vial</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

optimización de la reacción de transcripción in vitro para la producción de arnm mediante la monitorización cromatográfica en línea

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

El análisis cromatográfico descrito en este protocolo se puede utilizar para la optimización de IVT o para convertir una reacción de IVT por lotes en una reacción de lotes alimentados (Figura 1).
Para probar el efecto de diferentes composiciones de tampones en la cinética de la reacción de IVT, se mezclaron tres reacciones diferentes de IVT de acuerdo con el protocolo escrito en la Tabla 2. El tampón que contenía Tris, donde el pH se ajustó con HCl, se comparó con el tampón Tris, donde el pH se ajustó con ácido acético. Además, ambos tampones Tris se compararon con el tampón HEPES, donde el pH se ajustó con NaOH. La composición de todos los tampones 1x IVT fue de 40 mM de Tris/HEPES, 10 mM de DTT, 2 mM de espermidina y pH de 7,9.
De 100 μL de mezcla de reacciones IVT, se extrajeron 2 μL de muestra IVT de la reacción IVT y se enfriaron con 2 μL de EDTA 100 mM cada 15 min en la primera hora de incubación y luego cada 30 min hasta 180 min de incubación. El rendimiento final esperado de ARNm para esta condición de reacción fue de 15 mg/mL, lo que significa que la dilución de 2 veces debido al enfriamiento fue seguida por una dilución de 400 veces en MPA + NaCl para el análisis. La muestra se diluyó 800 veces en total, lo que significa que incluso con una producción de 15 mg/mL, la concentración de ARNm cargada en la columna cromatográfica analítica todavía estaba dentro de las concentraciones de la curva de calibración.
Las áreas de NTP y ARNm en A260 se integraron para cada muestra individual en cada punto de tiempo individual (tx). A continuación, las áreas se convirtieron en concentraciones de ARNm, utilizando la curva de calibración de ARNm y el porcentaje de consumo para los NTP, utilizando el área A260 de NTP a 0 min (t0) como un 100% (véase la ecuación a continuación).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
Los resultados se pueden mostrar como gráficos para cada reacción individual de IVT, donde el tiempo se muestra en el eje x y la concentración de ARNm y los NTP restantes se muestran en el eje y (Figura 2A). Todas las IVT, es decir, las concentraciones de ARNm en función del tiempo, también se pueden trazar juntas en un gráfico, y se puede estudiar la cinética de producción de ARNm y seleccionar las condiciones óptimas de IVT (Figura 2B).
Para el experimento de lotes alimentados, se mezcló IVT como se describe en la Tabla 3. De 300 μL de mezcla de reacción IVT, se extrajeron 2 μL de muestra IVT de la reacción IVT y se enfriaron con 2 μL de EDTA 100 mM cada 30 min. Además, la muestra se tomó inmediatamente después de cada adición masiva de NTP+MgCl2 . Se preparó previamente una solución de alimentación que contenía 42,4 mM de cada NTP y 152,5 mM de MgCl2 , y se mezclaron 106 μL de cada NTP individual de 200 mM con 76,2 μL de 1 M MgCl2. Se estableció un régimen de alimentación, donde se añadió bolo cada hora (a los 60 min, 120 min, 180 min y 240 min de incubación). El régimen de alimentación se describe en la Tabla 3 : Las muestras se analizaron casi en tiempo real con análisis como se describe para la reacción masiva de IVT. Después de 300 min de monitoreo, se extinguió la reacción de IVT.
Los resultados se pueden mostrar como la producción restante de NTPs/ARNm durante el tiempo de incubación. Dado que las adiciones de alimento en bolo también diluyen la reacción de IVT, la concentración de ARNm en IVT disminuye en cada adición de alimento (Figura 3A). El aumento de la masa de ARNm también puede medirse y presentarse mediante factores de transcripción (definidos comoARNm m/ADNp m), que muestran un aumento lineal de la producción de ARNm a lo largo del tiempo (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Figura 1: Resumen esquemático (A) Representación del flujo de trabajo de optimización de IVT con cuantificación de análisis cromatográfico en línea de NTP y ARNm. (B) Cromatogramas representativos de una reacción IVT por lotes muestreada en (i) t0, (ii) punto medio, (iii) puntos de tiempo de reacción final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Figura 2: Gráficos de IVT por lotes. (A) Gráfico representativo de la reacción de IVT con la producción de ARNm y el consumo de NTP en el eje y. La meseta de concentración de ARNm visible a los 120 - 180 min de incubación que se correlaciona con el consumo de NTP como NTP limitante (ATP) se consume a los 120 min. (B) Gráfico de IVT que muestra la influencia del tampón IVT en la cinética de IVT. El tampón A (Tris + ácido acético) mostró la producción de ARNm más rápida, seguido del tampón B (Tris + HCl) y el tampón C (HEPES+NaOH) como los más lentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Figura 3: Gráfico IVT de lotes federales. (A) Gráfico de IVT en el que se añadieron alimentaciones NTP+MgCl2 a 60, 120, 180 y 240 min. de concentración de ARNm en la reacción IVT disminuye en cada adición de alimento, debido a la dilución con alimentación NTP+MgCl2 . (B) El aumento de la masa de ARNm mostrado por el factor de transcripción es lineal a lo largo de la incubación de la reacción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Protocolo genérico IVT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Protocolo IVT por lotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Protocolo IVT de lotes federales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Optimización de la reacción de transcripción in vitro para la producción de ARNm mediante la monitorización cromatográfica en línea

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