Evaluación de genes anormales relacionados con el crecimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante la combinación de la tecnología CRISPR/Cas9 con el recuento de células

El alcance de la investigación es la patogénesis de la leucemia. Nuestro objetivo es identificar genes críticos para la proliferación anormal de HSPC mediante la combinación con ensayos CRISPR / Cas9 con CCK-8, revelando sus roles en la tumorogénesis y el potencial como objetivos farmacológicos.

La edición de genes basada en CRISPR/Cas-9 proporciona un enfoque simple y eficiente para lograr la eliminación de genes en sus células eucariotas. El desafío experimental actual es aumentar aún más la eficiencia de eliminación de CRISPR / Cas-9.

Nuestro protocolo utiliza ratones Cas-9 para suministrar células de médula ósea con expresión consultiva de Cas-9, por lo tanto, la administración viral de SGI en las células, lo que mejora en gran medida la eficiencia experimental.

[Presentador] Para comenzar, obtenga el fémur y la tibia del ratón experimental sacrificado. Transfiera el fémur y la tibia a una campana de flujo laminar inmediatamente después de la extracción para mantener la esterilidad. Con una jeringa estéril de un mililitro, enjuague la cavidad de la médula ósea con PBS que contenga FBS al 2% para recolectar células de la médula ósea. Pipetea las células de la médula ósea hacia arriba y hacia abajo de 30 a 50 veces para dispersarlas en células individuales. Transfiera la mezcla celular a un tubo de 50 mililitros y vórtice para mezclar bien. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular a 40 microlitros de tampón de lisis de eritrocitos y colóquelo en hielo durante cinco minutos para lisar los eritrocitos. Luego agregue 50 microlitros de solución azul de tripano. Mezclar bien y contar las células viables. A continuación, centrifugar las células a 800 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante. Luego vuelva a suspender las células a una concentración de uno a dos veces 10 a la potencia de seis células por mililitro en médula ósea, medio de preestimulación. Y siembre 10 mililitros de la suspensión en un plato de 10 centímetros. Incuba el plato durante 24 horas a 37 grados centígrados. Para recolectar las células preestimuladas al día siguiente, agregue de cinco a 10 mililitros de PBS que contengan un 2% de FBS y enjuague la placa vigorosamente. Transfiera las células a un tubo nuevo y agregue azul de tripano a las celdas. Cuente las células viables en la mezcla. A continuación, centrifugar las células a 800 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en una solución de infección recién preparada a una concentración de aproximadamente 10 a la potencia de seis células por mililitro. Siembre cuatro mililitros de la suspensión en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Sellar la placa con parafilm y centrifugarla a 1.500 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados. Después de la centrifugación, vuelva a suspender suavemente las células con una pipeta sin cambiar el medio. Incube el plato durante cuatro a seis horas. Para la primera transfección, aspire aproximadamente tres mililitros de medio sobrenadante de cada pocillo en un tubo y agregue un volumen igual de medio de preestimulación de médula ósea. Si las células se aspiran accidentalmente, repita los pasos de centrifugación y resuspensión como se describió anteriormente. Para la transfección secundaria, al día siguiente, retire de dos a tres mililitros de medio de cada pocillo y agregue un volumen igual de solución madre retroviral recién descongelada junto con cantidades adecuadas de hepas y polygreen. Centrifugar la placa a 1.500 G durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de la centrifugación, vuelva a suspender suavemente las células y continúe incubando durante cuatro a seis horas. Ahora, reemplace el medio como se describió anteriormente e incube durante 24 horas. Lave la placa con PBS que contenga un 2% de FBS y recoja las células. Filtre las células a través de un tamiz de 70 micrómetros antes de contar las células viables con azul de tripano. A continuación, centrifugar las células a 800 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en DMEM que contienen 10% de FBS e interleucina-3 murina, interleucina-6 y factor de células madre. Centrifugar aproximadamente de 0,5 a 1x10 a la potencia de seis celdas a 800 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Almacene el sedimento celular a -80 grados Celsius para la extracción de ADN genómico. Ahora, agregue 1x10 a la potencia de cuatro celdas por pocillo en una placa de 96 pocillos, haciendo seis pocillos replicados por grupo. Luego agregue 100 microlitros de PBS estéril a los pocillos circundantes e incube hasta diferentes puntos de tiempo de 0, 24, 48 y 72 horas. Aspire el medio en cada punto de tiempo y agregue 110 microlitros de medio que contenga 1/10 de volumen de solución CCK-8 a los pocillos. Incuba la mezcla durante una hora. Finalmente, mida la absorbancia a 450 nanómetros con un espectrofotómetro de microplacas. El knockout de Trp53 aumentó significativamente la capacidad proliferativa de las células madre hematopoyéticas y progenitoras de ratón en comparación con los controles a las 24, 48 y 72 horas, según lo medido por el ensayo CCK-8. La eficiencia de edición de Trp53 se estimó en 7,3% utilizando el análisis TIDE. Y la secuenciación de próxima generación reveló mutaciones que ocurren en diferentes posiciones del gen.