Name: Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a utilizar un dispositivo de estiramiento equibiaxial neumático para estudiar respuestas mecánicas celulares en tiempo real mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución. Este método permite investigar la mecanobiología en células vivas.

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<ol><li>Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretching+device+for+high-resolution+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A stretching device for high-resolution live-cell imaging.</a> Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).</li>
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<li>Constantinou, I., Bastounis, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-stretching+devices%3A+advances+and+challenges+in+biomedical+research+and+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging.</a> Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).</li>
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<li>Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+Rho+and+mechanical+stretch+on+stress+fiber+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).</li>
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<li>Wipff, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).</li>
<li>Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrins+and+focal+adhesion+kinase+in+the+orientation+of+dermal+fibroblasts+exposed+to+cyclic+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Wound+J%22%5BJournal%5D)">Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain.</a> Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).</li>
<li>Chu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+hair+regeneration+through+the+alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages.</a> Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).</li>
<li>Le Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanochemical+feedback+between+curved+membranes+and+BAR+protein+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization.</a> Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).</li>
<li>Kosmalska, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+of+membrane+remodelling+during+cell+mechanoadaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation.</a> Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).</li>
<li>Quiroga, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensing+mechanism+controls+plasma+membrane+shape+homeostasis+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale.</a> Elife. 12, e72316(2023).</li>
<li>Casares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+fracture+during+epithelial+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydraulic fracture during epithelial stretching.</a> Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).</li>
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<li>Kechagia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laminin-keratin+link+shields+the+nucleus+from+mechanical+deformation+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling.</a> Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).</li>
<li>Andreu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force+loading+rate+drives+cell+mechanosensing+through+both+reinforcement+and+cytoskeletal+softening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening.</a> Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).</li>
<li>Phuyal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+stimulates+COPII+-dependent+secretory+trafficking+via+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1.</a> EMBO J. 41 (18), e110596(2022).</li>
<li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
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<li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7 (12), 53004(2012).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
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<li>Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stretching+devices+as+research+tools%3A+Engineering+and+biological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations.</a> Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).</li>
<li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+of+the+lung+extracellular+microenvironment+is+regulated+by+macroscale+tissue+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain.</a> Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).</li>
<li>Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3D+printed+stretching+devices+for+imaging+force+transmission+in+live-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells.</a> Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Mascarilla de acetato</td><td>JD Photodata</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Biorad</td><td>161-0140</td><td>Solución de acrilamida al 40%</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Referencia A3678</td><td>Persulfato de amonio para electroforesis, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281778</td><td>(3-aminopropil)trietoxisilano</td></tr><tr><td>Bomba microfluídica autónoma</td><td>Elveflow Cobalto</td><td>Cobalto Dual</td><td>Cobalto Dual</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Biorad</td><td>161-0142</td><td>Solución Bis al 2%</td></tr><tr><td>Hoja</td><td>Fisher Scientific</td><td>11733919</td><td>Grupo Didáctico Hoja did ctica X100 LAME BISTOURI ESTÉRIL N&deg; 23&nbsp; LAMD23&nbsp;</td></tr><tr><td>Clips</td><td>Sprintis</td><td>AKXX000001</td><td>Clips Bull Dog, 32 mm, de metal, capacidad 10 mm, niquelado</td></tr><tr><td>Tratador de corona</td><td>Productos electrotécnicos</td><td>BD-20AC, SKU:12051A</td><td>BD-20AC TRATAMIENTO DE CORONA DE LABORATORIO</td></tr><tr><td>Tazas</td><td>VWR</td><td>611-1368</td><td>VWR, vasos de precipitados, desechables, 250 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Tinción DAPI</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Panreac Qu&iacute; mica, SLU</td><td>131085-1212</td><td>Etanol 96% v/v para an&aacute; lisis, ACS- 2,5 L</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td>Fibronectina, de plasma humano, líquido&nbsp; 0.1%</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0.1 &micro; m</td><td>Tecnología de la vida</td><td>F8801, F8803</td><td>Perlas fluorescentes amarillas, verdes y rojas para la evaluación de la resolución</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0.2 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>F8809, F8810</td><td>Perlas fluorescentes amarillas, verdes y rojas para la calibración de la deformación</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6403</td><td>Solución de glutaraldehído al 50% en H2O</td></tr><tr><td>Interferómetro</td><td>Veeco&nbsp;</td><td>Wyko NT1100</td><td>Interferómetro para medir espesores de membranas PDMS</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Panreac Qu&iacute; mica, SLU</td><td>131090-1212&nbsp;</td><td>2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para an&aacute; lisis, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Laiton pesa</td><td></td><td></td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>Pañuelos sin pelusa</td><td>Berkshire</td><td>DURX670, DR670090920</td><td>Toallitas no tejidas</td></tr><tr><td>Lubricante (vaselina)</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td>Vaselina</td></tr><tr><td>Alineador de máscara</td><td>S&uuml; ss MicroTec&nbsp;</td><td>MJB4&nbsp;</td><td>Alineador de máscara para fotolitografía en placas de PMMA</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>475904</td><td>MOWIOL 4-88 Reactivo</td></tr><tr><td>Microscopio NIKON disco giratorio confocal</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E/B</td><td>equipado con Nikon Ti-S-ER&nbsp; etapa</td></tr><tr><td>Microscopio vertical NIKON</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td>equipado con platina Nikon NI-SH-E</td></tr><tr><td>Objetivo 60x</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo NIR 60X W</td><td>NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8</td></tr><tr><td>Solución PBS</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>DPBS, 10x</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>2401673921</td><td>Sylgard - 184 Kit de Elastómero de Silicona DN 109</td></tr><tr><td>Cubierta del anillo de placa de Petri (grande)</td><td>Proquinorte</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100</td></tr><tr><td>Cubierta del anillo de la placa de Petri (pequeña)</td><td>Proquinorte</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick&nbsp;</td><td>PDC-002</td><td>Generador de plasma de oxígeno</td></tr><tr><td>Placas y anillos de PMMA</td><td></td><td></td><td>Ver tabla de especificaciones de Excel en documentos complementarios</td></tr><tr><td>Prolongar</td><td>Invitrogen</td><td>P36930 /P36934</td><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td></tr><tr><td>Repel-Silane</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1332-01</td><td>PlusOne Repel-Silane ES</td></tr><tr><td>Anillos / anillo de goma</td><td>Tecnifil</td><td></td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>Recubrimiento por centrifugación</td><td>Laurel</td><td>WS-650Sz</td><td>Recubrimiento por centrifugación</td></tr><tr><td>SPY650-ADN</td><td>Espirocromo</td><td>SC 501</td><td>SPY650-ADN</td></tr><tr><td>Cuchara de dirección</td><td>VWR</td><td>231-0416</td><td>Espátula desechable corta Eco, cuchara y cuchara de doble punta, PP y aditivo EcoPure</td></tr><tr><td>Resina SU8 2100</td><td>Microquímica</td><td>Y111075</td><td>SU8-2100</td></tr><tr><td>Desarrollador SU8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Acetato de éter monometílico de propilenglicol</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-50ML</td><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina, biorreactivo suitab. Reactivo de electroforesis</td></tr><tr><td>Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>&nbsp; Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>IESMAT</td><td>T5039&nbsp;</td><td>Pinzas Dumont HP 7 Acero inoxidable. Punta de 0,17 x 0,10 mm. (Agar Scientific Ltd)</td></tr><tr><td>Controlador de vacío</td><td>GARCAP / Parker</td><td>&nbsp; 990-005203-005&nbsp;</td><td>Controlador de vacío</td></tr><tr><td>Controlador de vacío fluigent</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-N800</td><td>LineUp Flow EZ (n800mbar)</td></tr><tr><td>Papel de banco blanco</td><td>Raima</td><td>931.1001</td><td>&nbsp; Papel Raima 42 x 52</td></tr></tbody></table>

dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Equibiaxial Stretching Device for High Magnification Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy

Calibración y radialidad La correcta caracterización de la cepa obtenida es una garantía de reproducibilidad y control de los experimentos. Si bien se pueden agregar perlas fluorescentes a cada muestra para registrar con precisión la deformación, un paso de calibración previo garantiza una planificación adecuada del experimento, sabiendo la magnitud de la deformación que el experimentador desea aplicar a la muestra antes del estiramiento real. La deformación no solo dependerá del vacío aplicado, sino ...

Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Cells are continuously exposed to mechanical forces in physiological and pathological situations, including a variety of tensile and compressive stresses. ...

equibiaxial-stretching-device-for-high-magnification-live-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Se presenta en este artículo una plataforma novela de estiramiento que se puede utilizar para investigar las respuestas de células individuales a complejo deformación mecánica biaxial anisotrópico y cuantificar las propiedades mecánicas de los tejidos biológicos.

Una Plataforma Novela Estiramiento para Aplicaciones en Celular y Tisular Mecanobiología

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

Aquí se presenta el protocolo de la técnica Conpokal, que combina la microscopía de fuerza confocal y atómica en una sola plataforma de instrumento. Conpokal proporciona la misma célula, misma región, cerca de imágenes confocales simultáneas y caracterización mecánica de muestras biológicas vivas.

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

La microscopía de superresolución puede proporcionar una visión detallada de la organización de los componentes dentro del complejo sinaptonémico en la meiosis. Aquí, demostramos un protocolo para resolver proteínas individuales del complejo sinaptonémico Caenorhabditis elegans .

Microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal Caenorhabditis elegans

Aquí presentamos un dispositivo novedoso que aplica formas de onda de deformación isotrópicas y uniaxiales a las células, al tiempo que apoya el cultivo en sustratos con rigidez sintonizable y matrices proteicas personalizables. Esta plataforma sencilla y económica permite a los investigadores investigar cómo las señales mecánicas regulan la función celular tanto en estudios fundamentales como en contextos relevantes para enfermedades.

Una plataforma novedosa para el estiramiento e imagen celular in vitro

Aprende a utilizar un dispositivo de estiramiento equibiaxial neumático para estudiar respuestas mecánicas celulares en tiempo real mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución. Este método permite investigar la mecanobiología en células vivas.

Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

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