Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Estudiamos cómo las células responden y se adaptan a los estímulos mecánicos en un contexto fisiológico y patológico. Para ello, utilizamos el dispositivo de estiramiento para aplicar fuerzas externas, una tensión en este caso, a las células.

Hemos descubierto cómo las células y los tejidos celulares reaccionan a estímulos mecánicos específicos y cómo responden mecánicamente a otras señales biológicas.

Nuestro dispositivo de estiramiento es muy versátil en comparación con otros, ya que ofrece la posibilidad de estirar células cultivadas en geles de poliacrilamida de diferentes rigideces o realizar experimentos de compresión.

[Narrador] Para comenzar, coloque los anillos de PMMA en una hoja de papel de banco blanco. Rodea con cuidado el borde de la placa recubierta de PDMS con una cuchilla para garantizar un corte limpio a lo largo de toda la circunferencia. Use pinzas para levantar la membrana en un borde, luego pélela suavemente con el pulgar para separar uniformemente la mitad de la membrana del plato. Use los dedos para esparcir etanol al 96% de manera uniforme alrededor de toda la superficie superior del anillo de PMMA. Retire con cuidado la membrana PDMS de la placa levantándola del borde previamente levantado. Luego, colóquelo simétricamente sobre el anillo de PMMA cubierto de etanol, asegurándose de que no se arrugue y evitando que se estire. Luego, tome otro anillo de PMMA vacío y colóquelo encima del anillo de montaje. Use clips de metal para sellarlos, intercalando la membrana PDMS entre los dos anillos. Coloque la mitad inferior del anillo estirable en el soporte de montaje. Coloque el anillo PDMS intercalado en el anillo estirable y empújelo firmemente hacia abajo hasta que esté completamente asentado, asegurándose de que la junta esté colocada correctamente. Coloque los pesos circulares de latón encima de la muestra. A continuación, coloque la mitad superior del anillo de estiramiento de metal en la parte superior, alineando los orificios de los tornillos. Inserte todos los tornillos y apriételos. Corta el PDMS alrededor del anillo suavemente con una cuchilla. Cubra el conjunto con una placa de Petri para proteger la membrana del polvo. Prepare una dilución de 250,000 perlas fluorescentes de 0.2 micrómetros en PBS usando dilución en serie. Y coloque una gota de 10 a 30 microlitros de la solución de perlas en el centro del PDMS. Deje que se seque a una temperatura no superior a 40 grados centígrados para evitar problemas de confusión posteriores al curado. Ahora, monte el dispositivo de estiramiento en el soporte de la platina del microscopio y asegure el poste de estiramiento en el microscopio. Aplique generosamente lubricante en el área circular del poste. Monte el anillo de estiramiento preparado en el poste de estiramiento y atornille la tapa superior para sellar el conjunto. Luego, conecte la parte posterior de la caja de control de vacío a la fuente de vacío, seguida de la parte delantera de la caja al poste de estiramiento. Para realizar la calibración de deformación, elija un campo de interés que contenga una alta densidad de cordones y grupos de cordones reconocibles para el usuario. Adquiera una imagen en reposo del campo de visión seleccionado y guarde la posición. Aplique estiramiento a un nivel de vacío bajo de 20 milibares negativos, provocando movimiento en todas las direcciones. Ahora, vuelva a enfocar en el plano Z y mueva el escenario en direcciones XY para ubicar la misma región de interés y adquirir una imagen en el estado estirado. Luego, libere la tensión y repita los pasos con un nivel de vacío más alto. Almacene las imágenes adquiridas en una carpeta organizada por muestra. Nombre, la imagen de la cuenta de referencia adquirida sin estirar como reference_str1 y las imágenes estiradas a niveles de vacío crecientes como stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, etc. Para cuantificar la deformación, abra MATLAB y cargue el código de deformación del gel. Después de establecer los parámetros, defina las rutas de acceso de la carpeta principal y del experimento y ejecute el código. Luego, abra stretched_str1 como lo solicita el código, seguido del reference_str1. Ahora, calcule la matriz de deformación mediana para cada nivel de vacío. Después de repetir este proceso para al menos tres muestras, trace la matriz de deformación mediana frente al nivel de vacío para obtener la curva de calibración. Para recubrir el anillo PDMS, esterilícelo bajo luz ultravioleta durante 15 minutos. Debajo de un gabinete de bioseguridad, enjuague la placa debajo de la campana con PBS estéril. Después de aspirar todo el PBS utilizado para enjuagar la placa. Deposite una gota de 100 a 200 microlitros de la solución en el centro del anillo. Dibuje el perímetro de la gota con un marcador permanente desde la parte inferior de la membrana PDMS e incube. El día del experimento, lave la proteína de adhesión con PBS. Después de tripsinizar las células, proceda al recuento de células. Siembre un número apropiado de células en un pequeño volumen de aproximadamente 20 a 50 microlitros con medios celulares estándar para promover la unión e incube en una incubadora de dióxido de carbono con control de humedad. Después de 20 a 30 minutos, agregue suavemente 500 microlitros de medios sobre las células y regrese la placa a la incubadora para permitir una mayor propagación celular. Para un solo ciclo de liberación de estiramiento e imágenes, monte el anillo de estiramiento en la platina del microscopio como se demostró anteriormente. Después de localizar una celda de interés, registre su posición y capture una imagen de la celda preestirada. Aplique el nivel de vacío deseado correspondiente a la deformación del sustrato requerida en función de la curva de calibración para estirar la celda. Para localizar la celda de extensión, primero, vuelva a enfocar en el plano Z. Luego, muévase en las direcciones XY para centrar la celda en el campo de visión. Grabe imágenes durante la duración deseada. Navegue hasta la posición original de la célula y active el modo de adquisición del microscopio para asegurarse de que la captura de imágenes comience inmediatamente después de volver a enfocar. Suelte el estiramiento y vuelva a enfocar rápidamente manualmente en el plano Z. Capture imágenes de la celda liberada durante el tiempo requerido, ajustando manualmente el enfoque durante la adquisición. Para el posprocesamiento, abra Fiji y cargue las imágenes adquiridas en reposo y durante la tensión. Utilice la coincidencia de plantillas del complemento Fiji para seleccionar una región de la celda para la alineación. La calibración garantizó la reproducibilidad y el control de la deformación aplicada, confirmando una relación casi lineal entre el vacío y la deformación de hasta un 20%. El análisis de desplazamiento radial demostró isotropía y homogeneidad de la deformación sobre la membrana del PDMS. Las imágenes de fluorescencia de las células de fibroblastos bajo el estiramiento de células vivas revelaron invaginaciones de membrana al soltar el estiramiento, que se reabsorbieron en tres a cinco minutos. El reestiramiento de las células fijas permitió obtener imágenes en un estado estirado, evitando artefactos de plegamiento artificial. La membrana PDMS con una cuadrícula estampada facilitó la obtención de imágenes multimodales, lo que permitió la localización de las mismas células en microscopía electrónica de fluorescencia y barrido. Las células asentadas en geles blandos de PAA recubiertos con fibronectina formaron adherencias focales solo cuando se sometieron a ciclos de estiramiento cíclicos específicos en comparación con las células no estiradas.