Captura de roturas de sitios frágiles comunes mediante γH2A nativo. X ChIP

Nuestro lujo se centra en la pérdida de la datación, el papel de la inestabilidad común del sitio frágil en la regénesis tumoral. Trate de identificar movilidades virales en las células cancerosas del oncogén gyron que puedan explotarse terapéuticamente. De lo contrario, las tecnologías de imágenes y secuenciación, como la simpatía de células individuales y las imágenes de células vivas, proporcionan un mapeo de alta resolución de la inestabilidad genómica en masa.

Los modelos in vivo de la región, incluidos el ruido, los modelos de ratón modificados genéticamente y los sistemas CRISPR que nos rodean, se basan en investigar los mecanismos de la inestabilidad genómica de los oncogénicos en detalle. El interés a largo plazo de nuestro laboratorio es identificar debilidades específicas en las células cancerosas que pueden tratarse estratégicamente para tratamientos infectados con un enfoque en minimizar el daño a las células normales. Esto incluye explorar vulnerabilidades genéticas y epigenéticas para descubrir oportunidades terapéuticas normales.

Para comenzar, trate las células T HEK 293 con DMSO etil decolina e hidroxiurea en tres placas diferentes durante 24 horas. Después de lavar las células dos veces con PBS, centrifugarlas a 500 G cuatro, cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros de tampón frío A recién preparado e incube en hielo durante cinco a 10 minutos.

Observe la progresión de la lisis bajo un microscopio óptico para confirmar la lisis celular completa. Una vez lisada, centrifugar la suspensión celular a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y volver a suspender el pellet de núcleos en 500 microlitros de tampón frío A. Centrifugar de nuevo, y volver a suspender los núcleos intactos con 100 microlitros de tampón de nucleasa microcócica pipeteando de cinco a 10 veces. Agregue inmediatamente la cantidad predeterminada de nucleasa microcócica a las muestras.

Coloque los tubos en un rotador durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Regrese inmediatamente los tubos al hielo y agregue EDTA para terminar la digestión. Después del vórtice, agregue 500 microlitros de tampón B y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Incube el tubo en hielo durante cinco minutos para solubilizar las proteínas. Para granular el material insoluble, centrifugar las muestras a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante transparente a nuevos tubos de 1,5 mililitros, etiquetados como la fracción de cromatina nativa.

Para verificar la fragmentación de la cromatina, alícuota 10 microlitros del sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Mezclar el sobrenadante con 20 microlitros de agua destilada y 30 microlitros de alcohol isoamílico cloroformo fenol. Después de un vórtice vigoroso, centrifugue los tubos a 20, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y observe tres capas distintas: una capa superior transparente, una capa intermedia blanca y una capa inferior amarilla.

Transfiera con cuidado 20 microlitros de la fase acuosa superior, que contiene ADN, a un tubo nuevo. Separe el ADN purificado en un gel de agarosa al 1,5% durante 30 minutos a 100 voltios. Visualice los patrones de digestión, asegurándose de que el tamaño de los fragmentos de cromatina esté principalmente entre 200 y 1.000 pares de bases.

Transfiera 20 microlitros de cromatina digerida a cada tubo, que contiene 180 microlitros de tampón de elución. Etiquete los tubos como muestras de entrada y guárdelos a menos 20 grados centígrados. Agregue 400 microlitros de cromatina digerida en otro tubo de 1,5 mililitros para inmunoprecipitación de cromatina, o chip.

Transfiera el anticuerpo gamma H2 AX a una muestra tratada con DMSO, tratada con etil decolina y tratada con hidroxiurea. Coloque los tubos en un rotador a cuatro grados centígrados durante cinco horas, o preferiblemente durante la noche. Mientras tanto, usando puntas de orificio ancho, alícuotas de 100 microlitros de proteína magnética AG de grado chip en un nuevo tubo de 1,5 mililitros.

Coloque el tubo en un soporte magnético durante un minuto, luego deseche con cuidado el líquido. A continuación, vuelva a suspender las perlas en un mililitro de PBS que contenga 0,5% de BSA. Gire el tubo a cuatro grados centígrados durante cuatro horas.

Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético durante un minuto y deseche el sobrenadante. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las perlas precodificadas en 100 microlitros de tampón B. Agregue 25 microlitros de la suspensión de perlas magnéticas precodificadas a cada tubo de muestra de viruta. Gire los tubos a cuatro grados centígrados durante dos horas, luego coloque los tubos de virutas en un soporte magnético y espere hasta que las perlas se adhieran al costado del tubo y la solución se vuelva transparente.

Deseche el sobrenadante transparente sin alterar las perlas magnéticas. Vuelva a suspender las perlas en un mililitro de tampón de lavado y gírelas a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético y espere hasta que la solución se aclare antes de desechar el tampón de lavado.

Después del lavado final, centrifugar brevemente los tubos a 400 G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados para eliminar el líquido residual. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético y retire con cuidado cualquier líquido restante del fondo del tubo. Después de verificar la eficiencia de extracción de anticuerpos del chip, utilizando western blot, agregue 50 microlitros de tampón de elución a cada una de las muestras de chip restantes.

Coloque los tubos en una batidora térmica y agite durante 15 minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un soporte magnético durante un minuto y recoja el eluit en tubos nuevos. Agregue 100 microlitros de tampón de elución a cada muestra de elución de chip y 180 microlitros de tampón de elución a cada muestra de entrada.

Luego agregue 200 microlitros de alcohol isoamílico fenol cloroformo a cada muestra y agite los tubos vigorosamente para mezclar. Después de centrifugar las muestras, transfiera cuidadosamente la capa acuosa superior a los tubos que contienen 19 microlitros de acetato de sodio de tres molares y dos microlitros de solución de glucógeno. Mezclar en vórtice de los tubos.

Agregue 500 microlitros de etanol al 100% a cada muestra y haga un vórtice completo. Coloque los tubos a menos 20 grados Celsius durante dos horas o durante la noche para precipitar el ADN. Luego centrifuga los tubos antes de desechar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo en un mililitro de etanol al 70%.

Una vez que se elimina el etanol residual por centrifugación, seque al aire los gránulos de ADN durante dos o tres minutos antes de volver a suspenderlos en 400 microlitros de tampón TE. Las concentraciones más altas de nucleasa microcócica condujeron a una digestión más extensa de la cromatina, lo que resultó en un predominio de fragmentos de mononucleosomas. Por el contrario, a concentraciones más bajas de nucleasas microcócicas, la mayoría de los fragmentos de cromatina eran más grandes, a menudo superando un kilo de base.

Los niveles de Gamma H2 AX se elevaron significativamente en las células con estrés de replicación, tratadas con etil decolina, en comparación con los controles tratados con DMSO, como se muestra en las muestras de entrada tanto para el chip nativo como para el chip reticulado.