Mapeo mecánico de esferoides mediante espectroscopía de Brillouin
12 de diciembre de 2025
Este artículo describe un protocolo para la caracterización mecánica de esferoides vivos dentro de una matriz 3D utilizando la microespectroscopía de Brillouin. Este método totalmente óptico permite la visualización de esferoides con resolución a microescala y propiedades mecánicas cuantitativas. Este enfoque tiene implicaciones para la fenotipización mecánica; por ejemplo, determinar estados patológicos de esferoides tumorales dentro de un microambiente 3D.
Estamos utilizando espectroscopía de Brillouin para evaluar de forma no invasiva la mecánica celular y así entender el papel de la mecanobiología en la progresión de la enfermedad. Las tecnologías no invasivas, como la espectroscopía de Brillouin, nos permiten caracterizar la mecánica en tres dimensiones, pero sin alterar la muestra. Para empezar, pretrata los pozos de la placa del micropozo añadiendo 500 microlitros de solución de enjuague antiadherente a cada pozo.
Centrifuga la placa a 1.300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar las burbujas de aire, retira la solución antiadherente de los pozos. A continuación, añade un mililitro de PBS a cada pozo y aspira completamente.
Tras repetir el lavado con PBS, determina el número de células por esferoide y el número de esferoides por gel según el diseño experimental. Haz pellets a las células y resuéltalas en un mililitro de DMEM suplementado. Luego añade un mililitro de esta suspensión de celda en un pozo de la placa del micropozo y mezcla bien.
Centrifuga la placa a 100 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Observa la placa del micropozo bajo el microscopio para confirmar la distribución uniforme de las células y que se han asentado en el fondo de los pozos. Incubar las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir la formación de esferoides.
Para extraer los esferoides, retira suavemente y lentamente los medios culturales sin molestar a los esferoides. Corta la punta de la pipeta recubierta de PBS/FBS para ensanchar la abertura y añade 500 microlitros de PBS a cada pozo para desalojar los esferoides. Recoge el PBS que contiene los esferoides en un tubo.
Luego transfiero 50 microlitros de la suspensión esferoide a un pozo de una placa de 96 pozos. Para facilitar el contar, dibuja una cruz en el fondo del pozo usando un marcador permanente y cuenta el número de esferoides en este volumen bajo el microscopio. Utiliza la ecuación para calcular el número total de esferoides.
Abre el software SpectraLok y espera hasta que se detecten todos los dispositivos conectados. Luego selecciona la cámara espectrómetro. Instala el cubo de acrílico en el soporte de muestras del microscopio con el lado transparente mirando hacia la lente objetivo.
Baja la lente objetivo tanto como puedas y centra el cubo debajo de ella. Asegúrese de que el camino óptico en el microscopio esté configurado para que la cámara espectrómetro quede expuesta girando el selector de puertos rotatorios para L.In la ventana de la cámara SpectraLok, establezca el tiempo de exposición del sensor a 500 milisegundos y la ganancia de software a 100. Pulsa Capturar y mueve lentamente la lente objetivo hacia arriba.
Sigue levantando el cristal hasta que los picos de Brillouin sean visibles y su intensidad se estabilice, indicando que el punto focal está situado dentro del cubo de acrílico. Ahora, abre la ventana de control Pump Killer, o PK. Haz zoom en uno de los órdenes Brillouin más brillantes y ajusta la posición del actuador de presión en incrementos de 100 micrómetros haciendo clic en mover rel para minimizar la intensidad máxima de Rayleigh.
Si la señal de Rayleigh aumenta, haz clic en Invertir para cambiar la dirección de ajuste. Una vez que disminuye la intensidad máxima de Rayleigh, se ajusta finamente la presión del etalón en incrementos más pequeños de 10 micrómetros. En la ventana de la cámara, haz zoom en uno de los pedidos de Brillouin.
Pulsa S para visualizar las franjas a las que se aplica la LUT a la imagen de la cámara. Abre la ventana de Configuración y pulsa Calibración Rápida para recalcular automáticamente el desplazamiento horizontal óptimo de las franjas. Tras verificar la alineación de la franja, ajusta los ejes de la lente colimadora para maximizar la eficiencia de acoplamiento de la luz del Pump Killer al espectrómetro.
Luego abre la ventana de Spectrum y haz clic en Desenrollar para recuperar el Spectrum. En un cubo acrílico homogéneo, intenta supresión total de la señal de Rayleigh y ajusta hasta que la señal de Brillouin sea claramente visible. Para guardar los parámetros optimizados, haz clic en Actualizar Todo y luego Guardar Todo en la ventana de control PK.
Finalmente, en la ventana principal, haz clic en Guardar en la sección de E/S de archivo para almacenar la configuración. Tras abrir el software de escaneo, instala la placa de Petri con fondo de cristal que contiene la muestra de esferoides de hidrogel en lugar del cubo de acrílico. Quita la tapa de la placa de Petri, añade suficiente medio para sumergir el gel y coloca una capa de cubierta encima para evitar el movimiento del gel.
Localiza el esferoide bloqueando primero el rayo láser. Cambia el camino óptico del microscopio al ocular y enciende la iluminación de luz blanca. Usando el joystick, controla manualmente la etapa de muestra para localizar y enfocar el esferoide.
Adquiere una imagen de campo brillante de la esferoide y ajusta el brillo de la iluminación girando la rueda de control. Cambia el camino óptico a R para exponer la cámara del microscopio y ajusta el tiempo de exposición según sea necesario. A continuación, ajusta el puerto del microscopio a L y captura el fondo con el láser aún bloqueado.
Desbloquea el láser y, dependiendo de la relación señal-ruido deseada, selecciona un tiempo de exposición entre 200 y 500 milisegundos. Del espectro sin envolver, selecciona la gama de ajuste de la pica Brillouin. Ajusta el valor umbral a aproximadamente la mitad de la intensidad máxima de Brillouin y excluye cualquier pico de Brillouin con amplitud por debajo del umbral.
Aplica corrección de longitud de onda al láser según todos los pares de picos de Brillouin identificados. Por último, elige la geometría del escaneo ráster ajustando el ancho y el tamaño del paso, y comienza el escaneo para registrar las mediciones. Imágenes representativas de un esferoide de células madre mesenquimales incrustadas en hidrogel mostraron mapas distintos de desplazamiento de Brillouin y ancho de línea de Brillouin, junto con imágenes correspondientes de campo brillante, núcleos y fluorescencia de filamentos de actina.
El mapa de desplazamiento de frecuencia de Brillouin de baja resolución se segmentó en regiones de gel y esferoides basándose en el contorno trazado manualmente a partir de la imagen del campo claro. Los píxeles ambiguos resultantes del muestreo reducido fueron excluidos del análisis, mientras que se crearon máscaras binarias claras para las regiones de gel y esferoides para extraer los valores BFS. La comparación de mapas BFS de alta y baja resolución demostró que el muestreo de testigo proporcionaba valores medios de BFS comparables a los escaneos de alta resolución, indicando una medición consistente de la mecánica de volumen esferoide.
Nuestro protocolo proporcionará una plataforma que permitirá a los investigadores estudiar muchas enfermedades relacionadas con la mecanobiología. Será interesante ver si los cambios en el desplazamiento de Brillouin que se correlacionan con propiedades mecánicas celulares son marcadores efectivos para las etapas de progresión de la enfermedad. Evaluaremos cómo los tratamientos farmacológicos influyen en la mecánica esferoide a lo largo de escalas temporales que imitan la progresión de la enfermedad.
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Resumen
Este artículo describe un protocolo para la caracterización mecánica de esferoides vivos dentro de una matriz tridimensional mediante microespectroscopía Brillouin. Este método no invasivo permite evaluar la mecánica celular y tiene implicaciones para comprender la progresión de enfermedades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Mecanobiología
- Mecánica celular
- Microentornos 3D
Antecedentes
- La espectroscopía Brillouin es una técnica no invasiva.
- Permite la caracterización de la mecánica en tres dimensiones.
- Este método no altera la muestra durante el análisis.
- Comprender la mecanobiología es crucial para los estudios sobre la progresión de enfermedades.
Objetivo del estudio
- Evaluar las propiedades mecánicas de los esferoides tumorales.
- Determinar estados patológicos dentro de una matriz tridimensional.
- Mejorar las técnicas de fenotipado mecánico.
Métodos Utilizados
- Preparación de placas de micropocillos con solución antiadherente.
- Centrifugación para eliminar burbujas de aire.
- Uso de PBS para lavar los pocillos.
- Aplicación de microespectroscopía de Brillouin para el análisis.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de esferoides con resolución a escala microscópica.
- Logro de la evaluación cuantitativa de las propiedades mecánicas.
- Conocimientos sobre el fenotipado mecánico de esferoides tumorales.
- La evaluación no invasiva confirmó ser efectiva para muestras vivas.
Conclusiones
- La microespectroscopía Brillouin es una herramienta valiosa para la mecanobiología.
- Este método puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos de las enfermedades.
- Aplicaciones potenciales en la investigación del cáncer y en estrategias de tratamiento.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectroscopía Brillouin permite la obtención no destructiva de mapas mecánicos con alta resolución de modelos de esferoides tridimensionales, proporcionando información crítica sobre las interacciones célula-matriz y la mecanobiología relacionadas con la progresión de enfermedades. Esta capacidad respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al cuantificar propiedades biomecánicas en sistemas fisiológicamente relevantes. La integración de estas mediciones contribuye a la validación de objetivos y reduce los riesgos asociados a hipótesis mecanicistas a lo largo del proceso de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de la mecánica celular y de la matriz en 3D, apoyando la validación funcional de objetivos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al vincular las propiedades biomecánicas con fenotipos relevantes para la enfermedad.
- Brinda confianza predictiva para la selección de carteras al proporcionar datos no invasivos y reproducibles.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas validados de esferoides 3D para cribado de compuestos y estudios mecanicistas posteriores.
- Proporciona lecturas mecánicas cuantitativas y estandarizadas para la reproducibilidad y comparabilidad del ensayo.
- Permite la evaluación escalable y sin contacto de la mecánica de las muestras para una evaluación confiable de intervenciones candidatas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea la mecánica de esferoides 3D con marcadores biofísicos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar datos mecánicos sólidos y fisiológicamente relevantes.
- Facilita estudios longitudinales de los efectos de fármacos sobre la mecánica de esferoides para modelar la progresión de la enfermedad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La espectroscopía Brillouin se integra en el continuo de descubrimiento desde estudios mecanicistas iniciales hasta la validación preclínica, permitiendo un flujo de datos continuo a través de las etapas de I+D.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al mapear cambios biomecánicos en modelos 3D.
- Selección: Proporciona resultados mecánicos cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mapas mecánicos de alto contenido y resultados estadísticos para la comparación de condiciones y el apoyo en la toma de decisiones.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos mecánicos in vitro con marcadores de enfermedad in vivo, favoreciendo la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la fenotipificación mecánica no invasiva en diversos sistemas modelo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Permite evaluaciones mecánicas estandarizadas, escalables y reproducibles en sistemas tridimensionales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al reducir los riesgos biológicos en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos basados en datos mecanobiológicos sólidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectroscopía óptica y técnicas de cultivo celular tridimensional.
- Necesita instrumentación especializada para la adquisición y análisis de espectros de Brillouin.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y de procesamiento de datos.
- La adaptación a diferentes tipos de esferoides y matrices de hidrogel puede requerir la optimización del protocolo.
- La resolución y el rendimiento están limitados por la configuración del sistema óptico y los parámetros de escaneo.
