Name: Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende un método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias. Esta técnica mejora el análisis de la patogénesis fúngica mediante microscopía de fluorescencia.

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Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Marcar las esporas con fluorescencia intracelular
<ol>
	<li>Teñir 1 x 106 esporas en éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE), Cell Tracker Orange o Cell Tracker Red (o tinte intracelular de su elección) a 5 μM durante 30 min a 30 °C, luego lavar con PBS y centrifugar las esporas a 12.000 x g. Repita este lavado una vez.</li>
	<li>Prepare el inóculo de esporas a la concentración adecuada para que 25 μL contengan la dosis de esporas adecuada para un ratón.</li>
</ol>
2. Inocular esporas de ratón mediante inhalación por aspiración con anestesia con isoflurano
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente anestésico volátil y debe usarse dentro de una cabina de bioseguridad con conductos o una campana de gases.
<ol>
	<li>Para preparar el frasco de exposición al isoflurano, coloque una servilleta doblada en un frasco de Nalgene con tapa de rosca de 1 L y coloque un círculo de malla de plástico sobre la servilleta como plataforma para los ratones. Agregue 2 ml de isoflurano a la servilleta, cierre el frasco y espere 1-2 minutos para que el gas se equilibre en el recipiente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Figura 1: Aparato para el método de inoculación de esporas en gota abierta de isoflurano. Se coloca una servilleta doblada en el fondo de un frasco con tapa de rosca de 1 L, y luego se inserta una malla de plástico circular para que actúe como plataforma para los ratones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Antes de exponer al ratón a la anestesia, prepare una pipeta con 25 μL del inóculo. Coloque el ratón en el recipiente de isoflurano e inclínelo para controlar la pérdida del reflejo de enderezamiento, donde el ratón ha perdido el conocimiento y está boca abajo. Esto suele tardar unos 10 s.</li>
	<li>Controle la frecuencia respiratoria (RR) hasta que disminuya a 50-80 respiraciones por minuto (lpm) constantes, aproximadamente el 50% de la frecuencia respiratoria en reposo. Esto suele tardar otros 10 s. En este momento, retire el ratón del frasco de isoflurano. NOTA: Se trata de una alta concentración de isoflurano, que producirá una rápida inducción de la anestesia, y el ratón debe ser vigilado muy de cerca. La sobredosis letal de isoflurano es un riesgo, ya que la concentración de isoflurano puede ser variable y la curva dosis-respuesta al isoflurano es muy pronunciada. Si la frecuencia respiratoria desciende por debajo de 50 lpm y/o es irregular, retire el ratón del isoflurano, deje que se recupere durante 3-5 minutos y vuelva a intentarlo (un máximo de dos intentos repetidos).</li>
	<li>Confirmar la profundidad anestésica por falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie. Luego, coloque el mouse en posición supina en una mano y permita que el mouse tome de 3 a 5 respiraciones jadeantes regulares con una frecuencia creciente (comenzando a 50-60 lpm) y vigor. Al comenzar, coloque la punta de la pipeta en la parte posterior de la orofaringe del ratón y libere el inóculo durante una inhalación. NOTA: Estos jadeos a través de la boca sacuden la cabeza inferiormente debido al reclutamiento de músculos accesorios para la respiración. Cuando se inserta la pipeta durante estos jadeos, la boca debe abrirse con cada jadeo. Si la boca no se abre, el ratón no está suficientemente anestesiado y es probable que no inhale el contenido de la orofaringe. La pipeta debe presionar la lengua, empujándola hacia el fondo y la parte delantera de la boca para evitar que se trague el inóculo. Cuando la pipeta está en la boca y el ratón está adecuadamente anestesiado, el ratón abrirá la boca con cada jadeo.</li>
	<li>Con la mano y el pulgar sosteniendo el ratón, palpa si hay crujidos en los aspectos posterior y anterior del tórax del ratón para confirmar la inhalación del inóculo.</li>
</ol>
3. Eutanasia de ratones
<ol>
	<li>Inyectar al ratón por vía intraperitoneal un cóctel de 200 mg/kg de ketamina y 24 mg/kg de xilacina 10 minutos antes del momento del sacrificio.</li>
	<li>Espere 10 minutos después de la inyección hasta que el ratón entre en un plano quirúrgico de anestesia, confirmado por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie.</li>
</ol>
4. Perfusión de pulmones con PBS y formalina
<ol>
	<li>Rocíe el ratón anestesiado con etanol al 70%. Use tijeras para cortar la piel del ratón y separar la piel para exponer el peritoneo por todos lados. Tira de la piel de la mitad superior del ratón sobre su cabeza, sacando los brazos de la piel.</li>
	<li>Cortar la membrana peritoneal en el esternón y a lo largo de la cara inferior de la caja torácica, exponiendo el peritoneo. Desplaza el hígado hacia abajo, revelando el diafragma. Use tijeras para perforar cuidadosamente el diafragma lejos del parénquima pulmonar para evitar perforar un agujero en los pulmones. NOTA: La perforación inadvertida de los pulmones hará imposible el inflado posterior del aire.</li>
	<li>Después de perforar el diafragma, el aire entra en el tórax, colapsando los pulmones. Corta la caja torácica del lado izquierdo para revelar el corazón. Inyectar 5-10 mL de PBS en el ventrículo derecho con una aguja de 30 G a razón de 1 mL por 5 s (para evitar dañar los vasos), blanqueando rápidamente los pulmones. PRECAUCIÓN: La formalina es una sustancia volátil peligrosa que debe manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con conductos o una campana de gases.</li>
	<li>Cuando termine, retire la aguja y use una aguja nueva para inyectar 5 mL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10% en el ventrículo derecho a la misma velocidad.</li>
</ol>
5. Inflar el pulmón perfundido en el aire
<ol>
	<li>Retira la mitad anterior de la caja torácica. Para exponer la tráquea, corte las costillas superiores y las clavículas a la derecha y a la izquierda del cuello. Tenga cuidado de evitar cortar cerca de la línea media donde se encontrará la tráquea. Con pinzas, sujete las costillas superiores y las clavículas restantes en la línea media del cuello y tire hacia arriba hasta que la tráquea quede expuesta.</li>
	<li>Prepare un hilo de sutura de 10 cm de longitud, páselo por debajo de la tráquea y haga previamente un nudo suelto en el extremo inferior de la tráquea expuesta. Prepare una jeringa de aire de 1 mL con un catéter de 18 G. Use una aguja de 18 G para hacer un agujero en la tráquea en el extremo superior de la región expuesta.</li>
	<li>Coloque el catéter en ese orificio, asegurándose de un ajuste relativamente apretado para evitar que el aire se escape. Inyecte lentamente 1 ml de aire en los pulmones en el transcurso de 10 s, vigilando la inflación pulmonar de todos los lóbulos. El inflado completo hace que los pulmones se envuelvan ligeramente alrededor del corazón y llenen el volumen que ocupan en el diafragma no perforado.</li>
	<li>Tire del nudo con fuerza alrededor de la tráquea y retire el catéter. Sostenga la tráquea y use tijeras romas para extraer los pulmones del ratón, teniendo cuidado de no perforar el pulmón.</li>
</ol>
6. Fijación por inmersión y deshidratación
<ol>
	<li>Coloque los pulmones en el borde superior de un tubo cónico de 50 mL lleno de 20 mL de NBF al 10%. Mantenga las roscas de sutura fuera de la cónica, enrosque la tapa e invierta la cónica para que los pulmones queden suspendidos boca abajo en 20 mL de NBF. Colócalo a 4 °C durante 24-48 h.</li>
	<li>Enjuague los pulmones con PBS, luego colóquelos en una solución de sacarosa-PBS al 30% (p/v) durante 72-96 h a 4 °C para deshidratar los pulmones en preparación para la criopreservación. Retire los pulmones de la sacarosa, colóquelos en un crimolde con un medio de temperatura de corte óptima (OCT) y congele la muestra a -80 °C.</li>
</ol>
7. Crioseccionamiento
<ol>
	<li>Equilibrar las muestras en criobloques OCT a la temperatura de -20 °C del criostato durante 1 h antes del corte. Seccione los bloques con espesores de 20-100 μm. NOTA: El inflado del aire puede provocar una mayor fragilidad de la muestra, y el corte con un mayor grosor puede prevenir la rotura del tejido durante el corte.</li>
	<li>Recoja las secciones en portaobjetos de vidrio y déjelos secar durante 30 minutos a 1 hora para garantizar la adherencia del tejido al portaobjetos. NOTA: Los portaobjetos pueden sostenerse a -80 °C en esta etapa.</li>
</ol>
8. Preparación y bloqueo de correderas
<ol>
	<li>Coloque los portaobjetos en un baño de PBS (en un plato o frasco Coplin) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para eliminar la OCT de los portaobjetos. NOTA: Es posible que las secciones más gruesas (40-100 μm) no se adhieran a los portaobjetos de vidrio tan bien como las secciones más delgadas, por lo que es mejor mantenerlas planas y en posición vertical en un plato en lugar de colocarlas de lado en un frasco Coplin.</li>
	<li>Seque los portaobjetos después de que la OCT se haya disuelto lejos del tejido. Use una toallita para secar el exceso de gotas del perímetro del portaobjetos alrededor de la muestra de tejido. </li>
	<li>Usa un bolígrafo de Papanicolaou hidrofóbico para dibujar un perímetro alrededor de la muestra y déjala secar durante 5 minutos.</li>
	<li>Prepare un tampón de bloqueo de solución de bloqueo sin animales con 0.3% de Tween-20 y 1:100 Fc Block en 300 mL por portaobjetos. NOTA: Para los objetivos intracelulares, se puede utilizar Tween-20 al 1%. Un volumen de 300 μL suele ser suficiente, pero el volumen necesario para cubrir completamente el tejido depende del tamaño del perímetro del marcador hidrofóbico. El tejido no debe secarse a partir de este punto.</li>
	<li>Deje la solución de bloqueo en los portaobjetos durante 1 h en RT.</li>
</ol>
9. Inmunotinción
<ol>
	<li>Lave el portaobjetos pipeteando el líquido y añadiendo 300-500 μL de PBS. Repite el lavado una vez.</li>
	<li>Prepare el anticuerpo primario conjugado AlexaFluor-647 anti-ratón EpCAM (clon G8.8) (marcador epitelial de las vías respiratorias) en una solución bloqueadora sin animales con Tween-20 al 0,33 % (o al 1 % para objetivos intracelulares). Añadir 300 μL por portaobjetos de esta solución y teñir toda la noche a 4 °C. NOTA: Los anticuerpos deben analizarse empíricamente para determinar la concentración, el tiempo y la temperatura de la tinción. Las secciones delgadas (8-20 μm) se tiñen durante 30 min a 37 °C y las secciones más gruesas (20-100 μm) a 4 °C durante la noche utilizando diluciones 1:100 para la mayoría de los anticuerpos. Si usa anticuerpos no conjugados, lávese 2 veces (como se indicó anteriormente) y aplique un anticuerpo fluorescente secundario durante un tiempo y una temperatura determinados empíricamente. Generalmente, la tinción secundaria de anticuerpos se realiza en RT durante 1 h con una dilución de 1:1000.</li>
	<li>Retire la solución de anticuerpos de la muestra y lave el portaobjetos con 300 ml de PBS durante 5 min. Repita este lavado una vez. Seque los portaobjetos, eliminando todo el exceso de líquido de la muestra y del vidrio circundante.</li>
	<li>Agregue una gota de soporte de montaje RT soft set (por ejemplo, SlowFade Glass) a cada pieza de pañuelo. Tenga cuidado de evitar burbujas dejando que la botella se asiente boca abajo y dejando caer lentamente cada gota sobre los pañuelos. Coloque un cubreobjetos del tamaño adecuado para que se extienda más allá de la muestra y el perímetro del marcador hidrofóbico.</li>
</ol>
10. Imágenes mediante microscopía fluorescente
<ol>
	<li>Utilice un microscopio fluorescente multicanal para escanear secciones enteras de pulmón de forma imparcial utilizando un objetivo con suficiente resolución para resolver esporas individuales y células huésped (por ejemplo, Zeiss Axioscan 7 utilizando un objetivo de aceite 20x con NA = 0,8 o similar). NOTA: Asegúrese de que la potencia del láser y la ganancia de voltaje PMT estén configuradas para maximizar las relaciones señal-ruido del objetivo sobre el fondo determinadas con un control de fluorescencia menos uno (FMO).</li>
	<li>Recoja suficientes mosaicos de imágenes para capturar todo el lóbulo pulmonar (por ejemplo, ~ 200 mosaicos de tamaño 400 μm x 400 μm). Utilice el programa de software del microscopio (por ejemplo, Zeiss ZEN 3.7 o similar) para exportar la imagen de mosaico fusionada para el procesamiento posterior.</li>
</ol>
11. Análisis espacial a través de QuPath
<ol>
	<li>En QuPath, un software gratuito de código abierto14, cree un archivo de proyecto y agregue las imágenes fluorescentes al archivo.</li>
	<li>Clasifique los píxeles de EpCAM+ como epitelio haciendo clic en la opción del menú superior Clasificar, luego en Clasificación de píxeles &gt; Crear umbral. Seleccione la resolución, el canal, el sigma de suavizado y el valor de umbral que mejor identifique la región de destino. Guarde el clasificador con un nombre único y seleccione Crear objetos.</li>
	<li>En la nueva ventana Crear objetos , seleccione Nuevo tipo de objeto como Anotación. Para el epitelio pulmonar, establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del orificio en 100 mm2. No es necesario seleccionar Dividir objetos aquí. Después de seleccionar Aceptar, se crearán las anotaciones y se pueden modificar a ojo usando la herramienta Pincel en el área superior izquierda.</li>
	<li>Para clasificar las esporas, repita los pasos de 11.3-11.4 utilizando el canal en el que se capturaron las esporas y haga que el nuevo objeto escriba Detección en lugar de Anotación. Establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del agujero en 0 mm2 y seleccione Dividir objetos.</li>
	<li>Para realizar un análisis espacial de las esporas, seleccione la opción del menú superior Analizar &gt; Análisis espacial &gt; Calcular la distancia firmada a las anotaciones 2D. Las distancias al epitelio de EpCAM+ se calcularán para cada espora detectada. Expórtelos a través de la opción del menú superior Medir &gt; Exportar mediciones.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Preservación de la localización de esporas fúngicas en pulmones para el análisis de microscopía fluorescente

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<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 aguja (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; Tarro con tapa de rosca &nbsp; (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Jeringas no estériles a granel 10 mL Luer Lock</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Inyección (solución estéril de xilacina)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador y diluyente sin animales, R.T.U.</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Catéter IV blindado con alas con catéter BD Vialon Material 18 G x 1.88 en</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block&trade;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Naranja CMRA Tinte</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta; &nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtros de 70 micras</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 anticuerpo monoclonal</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"</td> <td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Jeringas estériles de un solo uso (1 ml, deslizamiento de Leur)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa Monohidrato</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de alto vacío</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solución 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Dechra 1000001250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Limpiaparabrisas para tareas delicadas (4,4'' x 8,4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Tijeras para bebés</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Micro-Adson</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponado neutro (10%) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYMraces de cultivo de tejidos en matraces de construcción, T75, tapones de filtro VWR</td><td></td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moldes de incrustación</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Software</td><td>Código abierto</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Silk Suture tamaño de rosca 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>SlidesMicro Slides Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Montaje antidecoloración de fraguado suave (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compuesto, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE Juego de 2 bolígrafos de barrera hidrofóbica</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Coverglass, rectangulares (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Malla de alambre de plástico blanco</td><td>MAPORCH 789862904922</td><td></td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>microscopio fluorescente multicanal</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>software de microscopía</td></tr></tbody></table>

método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

En última instancia, este método produce imágenes inmunofluorescentes de los pulmones de los ratones utilizando el inflado fisiológico del aire para dejar las vías respiratorias intactas. Es importante destacar que varios puntos de control a lo largo del camino confirmarán que los componentes del protocolo se han realizado correctamente. Durante la inoculación, es importante confirmar que el inóculo fue aspirado palpando "crepitaciones" en la pared torácica posterior del ratón que indican que el líquido ha entrado en las vías respiratorias. Si no hay sensación de crujidos, es posible que el ratón se haya tragado el inóculo. La perfusión de los pulmones de ratón con PBS debe dar lugar a un moteado blanco de los pulmones seguido de un blanqueamiento completo de todo el pulmón (Figura 2A). Si hay un blanqueamiento incompleto, la perfusión posterior de formol no llegará a todas las áreas del parénquima pulmonar (Figura 2B). Al inflar el pulmón con aire, los pulmones deben distenderse lentamente hasta que alcancen el tamaño fisiológico. Después de atar la sutura traqueal para asegurar el aire dentro de los pulmones, los pulmones no deben contraerse de tamaño. Si lo hacen, es probable que el pulmón haya sido perforado durante el procedimiento.
Aquí, mostramos imágenes representativas de secciones con esporas marcadas de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (verde) y epitelio bronquiolar cilíndrico EpCAM+ (magenta) en pulmones inflados con aire y con líquido de formalina (Figura 3A, B respectivamente). Estas esporas se acumulan principalmente dentro de los bronquiolos distales y en los espacios alveolares inmediatamente adyacentes a esos bronquiolos distales, probablemente en los conductos alveolares. Los pulmones perfundidos con fijador inflado por aire contienen esporas que aparecen con mayor frecuencia dentro de los bronquiolos y se agrupan más cerca de los bronquiolos (Figura 3A), en lugar del fijador líquido, donde las esporas parecen ligeramente más dispersas desde el epitelio bronquiolar (Figura 3B). A través del análisis espacial QuPath, medimos la distancia de las esporas individuales al epitelio bronquiolar EpCAM+ más cercano para indicar el nivel de dispersión de las esporas lejos del bronquiolo y hacia espacios alveolares más distales. Mostramos que el inflado líquido dispersa las esporas más lejos de los bronquiolos en comparación con el inflado fisiológico del aire (Figura 4A, B). La perfusión vascular con inflado de aire preserva la posición natural de estas esporas en los bronquiolos distales y evita la dispersión artificial de estas esporas en espacios alveolares más distales mediante instilación fijadora intratraqueal.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Figura 2: Indicación de éxito de la perfusión pulmonar. (A) Los pulmones perfundidos con éxito serán completamente blancos. (B) Los pulmones incompletamente perfundidos aparecerán rosados o moteados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Figura 3: Imágenes representativas de la distribución de esporas en pulmones perfundidos con formalina inflados con aire frente a pulmones inflados con formalina. Se observa que las esporas fluorescentes intracelulares (verde) se distribuyen más cerca del epitelio bronquiolar EpCAM+ (magenta) en los pulmones inflados con aire (A) que en los pulmones inflados con formalina (B). Las imágenes se obtuvieron de secciones con una profundidad de 1,2 mm desde la superficie posterior de los lóbulos izquierdos de los ratones en cada grupo de tratamiento en un microscopio fluorescente multicanal con un aumento de 20x, y las baldosas se unieron utilizando software de microscopía. Barra de escala = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Figura 4: Comparación de la distancia entre las esporas (mm) y el epitelio bronquiolar entre pulmones inflados con aire y pulmones tratados con esporas inflados con formalina. Se recolectaron, procesaron y tomaron imágenes de los pulmones de 3 ratones por grupo de tratamiento durante 1,5 h después de la inoculación con 1 x 106 6 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Se muestrearon cuatro secciones por ratón a 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm y 2,0 mm de la superficie posterior del lóbulo izquierdo, se tiñeron y se obtuvieron imágenes en un microscopio fluorescente multicanal. Todas las esporas de cada grupo se detectaron y analizaron espacialmente en QuPath para determinar la (A) distancia al epitelio bronquiolar cilíndrico EpCAM+ más cercano, y (B) la mediana y los intervalos de confianza del 95% se muestran en unidades de micrómetros. Esporas de inflado de aire, n = 11.673. Esporas de inflado líquido, n = 9.837. Se realizó la prueba t de Mann-Whitney por falta de normalidad y p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

efficient-method-for-imaging-murine-lungs-that-preserves-spatial

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Este video describe un método de preparación de pulmones para imágenes en vivo ex vivo para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y las células estromales, utilizando agarosa para el inflado. En el protocolo de muestra, se describe el procedimiento de inflado de agarosa antes de observar las interacciones celulares vivas.

Inflado de agarosa en todo el pulmón: un método de preparación de los pulmones para la obtención de imágenes en vivo ex vivo

Se describe un método relativamente simple para ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones célula-estroma tumoral dentro de la metástasis de pulmón, utilizando reporteros fluorescentes en ratones. Uso de hilado de disco microscopía confocal, esta técnica permite la visualización de células vivas durante al menos 4 horas y podría adaptarse para estudiar otras condiciones inflamatorias pulmonares.

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Describimos a un no-invasivo multimodal enfoque basado en la tomografía molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación longitudinal del modelo ratón pulmonar la fibrosis inducido por la instilación intratraqueal doble de bleomicina la proyección de imagen.

Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones

Describimos la proyección de imagen óptica de ratones infectados con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) mediante fluorescencia de enzima reporter (REF). Este protocolo facilita la detección sensible y específica de M. tuberculosis en modelos animales preclínicos para la investigación de la patogenia, terapéutica y vacunas.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Aquí se describe un protocolo para determinar la carga micótica pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva por cuantificación de la coloración en cortes histológicos de plata de methanamine modificado de Gomori. Uso de este método dio lugar a resultados comparables con menos animales en comparación con evaluación de la carga de hongos por PCR cuantitativa de ADN fúngico de pulmón.

Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

En esta publicación, describimos protocolos para evaluar el aclaramiento mucociliario de las vías respiratorias (MCC) en ratones in vivo utilizando imágenes de radionúclidos de doble modalidad. Este protocolo está diseñado para un único protocolo de adquisición de tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y tomografía computarizada (TC) utilizando colimadores de cuerpo entero del ratón (MWB) en un sistema SPECT/CT dual.

Evaluación in vivo del aclaramiento mucociliario en ratones

Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.

Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende un método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias. Esta técnica mejora el análisis de la patogénesis fúngica mediante microscopía de fluorescencia.

Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias (Video) | JoVE Journal

Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

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