Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Nuestra investigación se centra en la caracterización de las vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus y su papel en las interacciones parásito-huésped. Investigamos la absorción de la composición por parte de las células dendríticas del huésped y la influencia potencial en la inmunomodulación. Demostramos que las células dendríticas absorben E. granulosus EV, lo que influye en la maduración y la presentación de antígenos. También identificamos proteínas inmunomoduladoras y antigénicas clave en la carga de EV, que pueden influir en las interacciones parásito-huésped y las respuestas inmunitarias.

Nuestro protocolo optimiza el cultivo de parásitos in vitro para mejorar la producción de VE pequeñas y garantiza un aislamiento de alta calidad e integra ensayos de células dendríticas para estudiar la inmunomodulación. Se puede aplicar en su totalidad o en partes. Nuestra investigación futura explorará los efectos in vivo de los EV de E. granulosus en las respuestas inmunitarias, su potencial como componentes de la vacuna y su impacto en las células dendríticas, los micrófagos y los modelos inmunitarios de estas células.

[Narrador] Para comenzar, limpie la superficie ventral del ratón sacrificado con enfermedad hidatídica con alcohol al 70%. Abrir quirúrgicamente la cavidad peritoneal para extirpar los metacestodos desarrollados con tijeras y fórceps. Luego, transfiera las masas de metacestodos a una placa de Petri estéril con fórceps. Retire el tejido conectivo con fórceps, si es necesario, para liberar los quistes de las masas de metacestodos. Lavar los metacestodos obtenidos con PBS suplementado a cuatro grados centígrados. Ahora, prepare el medio de cultivo utilizando todos los componentes necesarios y mezcle la solución suavemente por inversión. Transfiera cinco mililitros del medio de cultivo preparado a cada tubo Leighton. Agregue los parásitos al medio de cultivo e incube los tubos a 37 grados centígrados durante cinco días sin cambiar el medio. Recoja el medio de cultivo de parásitos de cada tubo de Leighton y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el medio recogido a 300 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Ahora, centrifuga el sobrenadante a 2.000g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante resultante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros con una pipeta. Centrifugar el tubo a 10.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares más pequeños. Con una pipeta, transfiera el sobrenadante a un tubo adecuado para el rotor de ultracentrífuga. Marque un lado del tubo con un marcador. Y coloque el tubo en el rotor con el lado marcado hacia arriba. Centrifugar los tubos a 100.000 g durante una hora a cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante rápidamente y deje reposar el tubo boca abajo durante un minuto. Lave el gránulo con al menos tres mililitros de PBS para eliminar las proteínas contaminantes. Vuelva a suspender el gránulo varias veces con una pipeta a lo largo de todas las caras del tubo, centrándose en el lado marcado donde se espera que esté el gránulo. Después de repetir la ultracentrifugación, vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de PBS. Transfiera la muestra resuspendida a un tubo de 1,5 mililitros y congele las vesículas extracelulares a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento. Rocíe al ratón CF-1 hembra de cinco a ocho semanas de edad sacrificado con etanol antes de colocarlo en una campana de cultivo de tejidos. Coloque el ratón sobre una tabla de disección en posición supina. Con fórceps y tijeras de disección, haga una incisión vertical en T por encima de la uretra y extiéndala horizontalmente hasta la parte superior de las extremidades inferiores. Con fórceps, separe la piel a lo largo de ambas extremidades traseras para exponer los huesos y tejidos de las piernas. Con las manos, retira la piel de cada pierna después de empujar desde el tobillo hacia el abdomen, tirando de la piel hacia el lado opuesto, dejando ambas piernas libres de piel. Ahora, retire con cuidado el fémur y la tibia con tijeras y fórceps, asegurándose de que no se rompan. Sujete la punta de cada hueso con fórceps. Y cortar los tendones para eliminar las fascias musculares alrededor de los huesos. Completa la limpieza del tejido muscular con servilletas de papel. Coloque cada hueso extraído en un tubo estéril de 50 mililitros que contenga dos mililitros de medio RPMI completo suplementado para eliminar los desechos. Después de desechar el medio, lave los huesos dos veces con etanol al 70% durante cinco minutos cada vez. Transfiera los huesos lavados a una placa de Petri estéril y corte las epífisis de dos huesos con unas tijeras de disección afiladas para acceder a las células de la médula ósea. Con una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 20 mililitros que contiene medio completo, enjuague con cuidado las células de la médula ósea de cada uno de los cuatro huesos en una placa de Petri estéril. A continuación, homogeneice suavemente el medio que contiene la médula eludida mediante pipeteo para eliminar el tejido conectivo óseo y los bultos celulares. Transfiera la muestra a un tubo cónico estéril de 50 mililitros, pasando las células a través de un filtro celular de polipropileno estéril de 70 micrómetros para eliminar el tejido conectivo y los restos óseos. Centrifugar las células a 450 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante, asegurándose de que el gránulo permanezca adherido a la pared del tubo. Después de incubar las células durante un minuto a temperatura ambiente, vuelva a suspenderlas en 500 microlitros de tampón de lisis de glóbulos rojos y neutralice el tampón de lisis con tres mililitros de medio completo. Centrifugar las células a 450 g durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de medio completo. Después de filtrar la muestra como se demuestra, cuente las células con un hemocitómetro. Agregue 300 nanogramos por mililitro de ligando de tirosina quinasa tres relacionado con FMS murino recombinante, o FLT3L, al medio de cultivo. Coloque las células en una placa de pocillos múltiples a una concentración de uno por 10 a la potencia de seis células por mililitro. Incube las células durante siete días a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono. Al tercer día, retire un mililitro de medio de cada pocillo sin alterar las células y reemplácelo con un mililitro de medio completo fresco precalentado, complementado con 150 nanogramos por mililitro de FLT3L murino recombinante. Las vesículas extracelulares, o EV, purificadas de la etapa larvaria de Echinococcus granulosus eran principalmente EV pequeñas con tamaños que oscilaban entre 50 y 200 nanómetros, confirmadas por dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea demostraron diferenciación morfológica durante siete días, progresando de células hematopoyéticas pequeñas y redondas a células estrelladas con extensiones citoplasmáticas. Después de una hora de incubación, las células dendríticas capturaron pequeñas VE marcadas con fluorescencia, que se colocalizaron con moléculas MHCIII en compartimentos endosómico-lisosomales, como lo confirmó la microscopía confocal.