Trasplante de pulmón de bioingeniería utilizando pulmones de ratón descelularizados y células endoteliales humanas primarias

La bioingeniería de órganos de tamaño humano requiere una gran cantidad de recursos, lo que a menudo excede la capacidad de los laboratorios académicos. La reducción del coste del desarrollo iterativo de protocolos acelerará el progreso de la investigación en este campo. El objetivo de este estudio es proporcionar el protocolo estandarizado para la bioingeniería pulmonar utilizando bloqueos corazón-pulmón de ratón. Todavía se desconoce qué células son apropiadas para la bioingeniería de órganos y cómo esas células deben integrarse en el cultivo del biorreactor de órganos. Es necesario comparar múltiples tipos de células y condiciones para establecer protocolos escalables y reproducibles.

Los ratones son animales de experimentación pequeños y fáciles de manejar. Sin embargo, aunque son pequeños, la arquitectura básica del pulmón es similar en todos los mamíferos. Al optimizar el protocolo en esta pequeña plataforma, podemos escalar los modelos animales láser simplemente multiplicando los resultados optimizados de acuerdo con el tamaño de los animales. Esta plataforma de bioingeniería pulmonar del tamaño de un ratón permite a los investigadores probar sus células madre de manera eficiente. Estas células modificadas genéticamente pueden ser preciosas o costosas de usar para toda la ingeniería pulmonar. Además, las células derivadas de pacientes también se pueden utilizar para crear modelos de enfermedades in vitro.

Los esfuerzos actuales implican probar múltiples tipos de células madre modificadas y células progenitoras, para descubrir el potencial de proliferación requerido y la capacidad diferencial para la bioingeniería pulmonar. Una vez que se identifiquen las células adecuadas, esta investigación se extenderá a un modelo animal más grande, como los cerdos.

[Narrador] Para comenzar, coloque el ratón sacrificado en posición supina sobre una mesa quirúrgica y fije las extremidades. Rocíe etanol al 70% uniformemente sobre el pecho y la superficie abdominal para esterilizarlo. A continuación, abra la cavidad abdominal a lo largo de la línea media que se extiende hasta el cuello, con unas tijeras de acero inoxidable, y divida el esternón. Reseque el diafragma de la pared torácica. Corte la pared torácica ventral para exponer las cavidades torácicas y extirpar el timo. Con una sutura de seda 4/0, legar la vena cava inferior y la vena cava superior derecha. Corta la aorta abdominal con unas tijeras de acero inoxidable para el drenaje. Con una jeringa estéril de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 27, inyecte tres mililitros de PBS estéril en el ventrículo derecho perforando la pared del ventrículo. Use fórceps Dumont para enrollar una sutura de seda 4/0 alrededor de la arteria pulmonar principal. Luego, corte una ventana de dos milímetros debajo de las válvulas de la arteria pulmonar, con unas tijeras de resorte, para acceder a la pared del ventrículo derecho. Inserte el catéter de la arteria pulmonar a través de la ventana y asegúrelo con la sutura de seda 4/0 preenrollada. Inyecte lentamente dos mililitros de PBS a través del catéter de la arteria pulmonar, usando una jeringa de cinco mililitros. Canular la tráquea con un catéter traqueal y amarrarla con una sutura de seda 4/0. Ahora, inyecte lentamente dos mililitros de aire a través del catéter traqueal con una jeringa vacía de cinco mililitros. Mantenga el aire durante 10 segundos para asegurarse de que no haya fugas de aire de los pulmones. Retire el bloqueo final del corazón y los pulmones. A continuación, transfiera el bloque corazón-pulmón resecado a una placa de Petri de plástico de 10 centímetros de diámetro que contenga agua desionizada, para la descelularización de los pulmones. Incube el bloque durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, con una jeringa de cinco mililitros, inyecte dos mililitros de agua desionizada estéril a través del catéter traqueal tres veces. Haga una pausa después de cada inyección para permitir que el líquido salga a medida que los pulmones retroceden. Del mismo modo, inyecte dos mililitros de agua a través del catéter de la arteria pulmonar. Inyecte dos mililitros de solución de Triton X-100 al 0,1% en los catéteres de la arteria traqueal y pulmonar. Transfiera el bloqueo corazón-pulmón a una placa de Petri e incube estáticamente en una solución Triton X-100 durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, para eliminar la solución Triton X-100 de los pulmones, inyecte dos mililitros de agua desionizada en el catéter traqueal y el catéter de la arteria pulmonar, y repita estos con dos mililitros de solución de desoxicolato al 2%. Después de extraer la solución de desoxicolato de los pulmones, inyecte dos mililitros de una solución molar de cloruro de sodio en los catéteres de la arteria traqueal y pulmonar. Incube el bloqueo corazón-pulmón durante una hora. Después de retirar la solución de cloruro de sodio con agua desionizada, inyecte dos mililitros de solución de trabajo de ADNasa I en los catéteres de la arteria traqueal y pulmonar. Incube el bloqueo corazón-pulmón durante una hora. Inyecte PBS estéril en los catéteres de la arteria traqueal y pulmonar para extraer la solución de ADNasa I. Después de la descelularización, confirme que los pulmones estén blancos y transparentes en los bordes. Agregue 70 mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales 2, o medio de cultivo EGM-2, al recipiente de vidrio y coloque el tapón de silicona encima del recipiente para sellarlo. Ensamble un tapón de silicona, un recipiente de vidrio, un tapón de rosca GL45 con tubo, una botella de vidrio esterilizable en autoclave de 250 mililitros y un tubo L/S 14 con accesorios de señuelo utilizando llaves de paso de tres vías. Inserte una aguja de calibre 20 en el tabique de silicona del tapón de rosca GL45. Llene el tubo A, B y C con medios de cultivo con una jeringa de 10 mililitros conectada a las llaves de paso uno y tres. Conecte el catéter de la arteria pulmonar del bloque corazón-pulmón descelularizado al tubo C a través de un accesorio de señuelo. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el catéter o tubo. Para la inyección por gravedad de células endoteliales, coloque un reservorio celular que contenga células endoteliales de la vena umbilical humana, o HUVEC, en un agitador magnético, asegurándose de que el reservorio esté a 30 centímetros por encima de la cámara del órgano. Encienda el agitador magnético a una velocidad de 120 RPM. Abra las llaves de paso uno y dos para permitir que la suspensión celular fluya hacia el andamio descelularizado, a través del tubo A, el tubo C y el catéter de la arteria pulmonar. Para la perfusión del cultivo de órganos, coloque la cámara del órgano en una incubadora de dióxido de carbono. Conecte el tubo B a un cabezal de bomba conectado a una bomba pulsátil. Cierre la puerta de vidrio de la incubadora. Asegúrese de que el tubo esté colocado correctamente entre la puerta y el sello de goma. Incube el andamio descelularizado a 37 grados Celsius durante tres horas para permitir que las células endoteliales se asienten dentro del andamio. Arranque la bomba a una velocidad de seis RPM, lo que da como resultado una perfusión de medios de dos mililitros por minuto utilizando tubos L/S 14. Observe el pulmón descelularizado que se expande ligeramente debido a la perfusión del medio. Luego, cierre la puerta de la incubadora. Para realizar el cambio de medios, detenga el accionamiento de la bomba. Conecte una jeringa estéril de 50 mililitros a la llave de paso tres y retire 50 mililitros de medios de la cámara. Llene otra jeringa estéril de 50 mililitros con 50 mililitros de medios precalentados. Inyecte la solución en un recipiente de vidrio y transfiera el medio a la cámara a través de la llave de paso tres, asegurándose de que la llave de paso se cambie correctamente. Reinicie la bomba pulsátil. Coseche el bloque corazón-pulmón reculular después de dos días de cultivo de órganos de perfusión. Los pulmones de ratón aparecieron blancos y translúcidos después de la descelularización, lo que indica la eliminación de componentes celulares, al tiempo que preservan la estructura pulmonar general. El análisis histológico de los pulmones de ratón descelularizados reveló estructuras alveolares intactas, sin componentes celulares restantes. Los pulmones de ratones recelularizados con tres veces 10 a la potencia de siete HUVEC después de dos días de cultivo de biorreactores basado en perfusión, exhibieron una distribución homogénea de HUVEC. Los HUVEC migraron a áreas alveolares periféricas, formando una red capilar, como se observó en los pulmones recullularizados.