Name: Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a evaluar el metabolismo mitocondrial en macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico mediante bioanalizador de flujo extracelular. Este protocolo permite medir la respiración dependiente de glutamina en tiempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>El etanol perjudica la bioenergética AM al cambiar a una respiración dependiente de glutamina

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo cónico de 15 mL&nbsp;</td><td>VWR International, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Se utiliza para preparar concentraciones de reactivos relacionados con las mitocondrias.</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>M6250</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>Se utiliza para raspar células MH-S de matraces T-75.</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Instrumento: contador de células</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Se utiliza para contar el número de células MH-S para placas para experimentos.</td></tr><tr><td>D-glucosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G8270</td><td>Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>4355720</td><td>Tratamiento experimental para células MH-S.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G1397</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>Software para análisis estadístico. Descargable después de la compra en https://www.graphpad.com/features.</td></tr><tr><td>Células MH-S</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRL-2019</td><td>Línea celular de macrófagos alveolares de ratón.</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga&nbsp;</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Se utiliza para preparar concentraciones de trabajo de reactivos relacionados con las mitocondrias.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: programa informático de hojas de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Software para la organización de datos y cálculos bioenergéticos mitocondriales. Se puede descargar después de la compra en https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>Se utiliza para lavar celdas MH-S.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-396</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Pro Software: programa de software informático para el diseño y análisis de ensayos</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>El ordenador está conectado al instrumento Seahorse XF Pro Analyzer. Descargable desde&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium: medio base de flujo extracelular, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Se utiliza para la preparación de reservas y concentraciones de trabajo de reactivos relacionados con las mitocondrias y el cultivo de células MH-S antes de las pruebas experimentales.</td></tr><tr><td>Kit de prueba de estrés por oxidación de glutamina Seahorse XF</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Contiene BPTES de stock, oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalizador de flujo extracelular</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Bioanalizador de flujo extracelular.</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak: cartuchos de fundente extracelular de 96 pocillos, placas de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos y solución calibrante</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Se utiliza para preparar células MH-S para ensayos utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.</td></tr><tr><td>Pipeta serológica&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotecnología, Inc.</td><td>sc-550678</td><td>Se utiliza para eliminar medios de las celdas MH-S.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>P4562</td><td>Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.</td></tr><tr><td>Matraces T-75</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-200263</td><td>Se utiliza para el cultivo de células MH-S.</td></tr></tbody></table>

evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

La exposición crónica al EtOH disminuye la dependencia de la glutamina en las células MH-S. La glutaminólisis es una vía crítica para la respiración mitocondrial, ya que apoya a la glutamina como una importante fuente de combustible para la bioenergética celular. Para determinar si la exposición crónica a EtOH altera la dependencia de las células MH-S de la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial, las células MH-S se trataron sin control de EtOH (Con) o EtOH, y se midió el OCR a lo largo del tiempo en respuesta a inyecciones seriadas de reactivos asociados con la respiración mitocondrial. Los perfiles bioenergéticos de OCR en respuesta a inyecciones seriadas de oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa), FCCP (desacoplador de protones) y R/A (inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III, respectivamente) se utilizan para calcular otros parámetros de la bioenergética mitocondrial, como la respiración ligada al ATP, la respiración máxima y la capacidad respiratoria de reserva. Todos los datos mostrados son réplicas biológicas adicionales de los grupos experimentales de células Con + media, Con + BPTES y EtOH + media, EtOH + BPTES MH-S que se publicaron en Crotty et al.11. Como se muestra en la Figura 2A, la oligomicina disminuyó el OCR debido a la inhibición del complejo V, el FCCP aumentó el OCR debido al desacoplamiento mitocondrial del potencial de membrana y la generación12 de ATP dependiente de las mitocondrias, y R/A desactivó eficazmente el OCR dependiente de las mitocondrias. Estos perfiles de las respuestas bioenergéticas de OCR a las inyecciones seriadas son consistentes con la guía del usuario para evaluar el estrés mitocondrial utilizando un bioanalizador de flujo extracelular13,14.
Después de medir el OCR basal en células MH-S tratadas con Con y EtOH, se cargó una inyección de control de medios o BPTES, un inhibidor de la glutaminasa 1. Las células MH-S de Con + medios frente a las células MH-S de Con + BPTES y las células MH-S de EtOH + BPTES no mostraron diferencias en los perfiles bioenergéticos de OCR (Figura 2A). Las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una disminución en la respiración basal dependiente de glutamina en comparación con Con + BPTES (medición #4 comparada con la medición #3 en la Figura 2A y la Figura 2B), lo que sugiere que EtOH disminuye la oxidación basal de glutamina de las células MH-S contribuyendo a la respiración mitocondrial. Las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una pérdida de respiración mitocondrial ligada a ATP dependiente de glutamina en comparación con Con + BPTES (Figura 2C). Aunque las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una pérdida atenuada en la respiración máxima dependiente de la glutamina en comparación con las células Con + BPTES (Figura 2D), las células EtOH + BPTES MH-S mostraron una disminución de la capacidad respiratoria de repuesto dependiente de la glutamina en comparación con las células Con + BPTES (Figura 2E). Estos resultados sugieren que las células EtOH MH-S tienen la capacidad de ser más dependientes de la glutamina para la respiración, como cuando están estresadas con FCCP, pero que pueden ser incapaces de hacerlo debido a un aumento en la demanda de glutamina que se ve compensado por una disminución en la biodisponibilidad de glutamina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo para medir la respiración mitocondrial dependiente de glutamina y la bioenergética en células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón. Las monocapas de células MH-S cultivadas en pocillos de placa de microcultivo de flujo extracelular (paso 3.1) se incubaron con medio base de flujo extracelular con suplementos añadidos (paso 3.2) a 37 °C en una incubadora humidificada sin CO2 durante 30 min-1 h (paso 3.4). El medio base de flujo extracelular con suplementos añadidos (paso 3.2) se utilizó como medio de control y para diluir las concentraciones de trabajo del inhibidor de la oxidación de la glutamina BPTES a una concentración final de 3 μM, el inhibidor del complejo mitocondrial V oligomicina (Oligo) a una concentración final de 0,5 μM, el desacoplador mitocondrial cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) a una concentración final de 0,5 μM, y los inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III rotenona/antimicina A (R/A) a 0,5 μM concentración final para los puertos de carga A-D en el cartucho de fundente extracelular superior (paso 3.7). La estrategia de inyección para los tiempos de mezcla, espera y medición para la ejecución experimental utilizando el bioanalizador de flujo extracelular fue: 3 min de tiempo de mezcla, 0 min de tiempo de espera y 6 mediciones de 3 min de tiempo de medida para el puerto A (control de medios o BPTES); 3 minutos de tiempo de mezcla, 0 minutos de tiempo de espera y 3 mediciones de 3 minutos de tiempo de medición para el puerto B (Oligo); Tiempo de mezcla de 3 minutos, tiempo de espera de 6 minutos y 3 mediciones de tiempo de medición de 3 minutos para el puerto C (FCCP); y 3 minutos de tiempo de mezcla, 0 minutos de tiempo de espera y 3 mediciones de 3 minutos de tiempo de medición para el puerto D (R/A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
Figura 2: El etanol crónico (EtOH) disminuye la respiración mitocondrial dependiente de glutamina en las células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón. Las células MH-S no fueron tratadas (Con) o tratadas con EtOH (0,08%, 72 h), y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) a lo largo del tiempo se midió utilizando un bioanalizador de flujo extracelular antes y después de la inyección con control de medios o un inhibidor de la oxidación de glutamina (GLN) (3 μM de BPTES), seguido de inyecciones seriadas de inhibidor del complejo V mitocondrial (0,5 μM de oligomicina, Oligo), desacoplador mitocondrial (0,5 μM de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona, FCCP) e inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III (0,5 μM de rotenona/0,5 μM de antimicina A, R/A). (A) Se utilizaron perfiles bioenergéticos OCR para calcular la respiración basal dependiente de glutamina (B), (C) la respiración ligada al ATP, (D) la respiración máxima y (E) la capacidad respiratoria ociosa. Los puntos lineales representan medias ± SEM (n = 4, #p &lt; 0,05 frente a Con + medio y *p &lt; 0,05 frente a Con + BPTES, ANOVA de un factor con post hoc de Tukey). Las barras representan medias ± SEM (n = 4, *p &lt; 0,05 frente a Con + BPTES, prueba t de Student). Los datos presentados son réplicas biológicas adicionales para los grupos experimentales tratados con medios de control y BPTES de células MH-S no tratadas con control y crónicas expuestas a EtOH, que se publican en Crotty et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

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Este protocolo proporciona un enfoque bioquímico para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de células leucémicas primarias con ensayo de flujo extracelular. La evaluación del perfil metabólico de estas células ayuda a caracterizar sus demandas, lo que conduce a una terapia personalizada.

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Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.

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La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

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La glucólisis es un marcador metabólico definitorio en múltiples sistemas biológicos. El monitoreo de la glucólisis mediante la medición del flujo extracelular de H+ es común, pero requiere una corrección para que sea cuantitativa e inequívoca. Aquí, demostramos cómo recopilar y corregir datos de flujo extracelular para distinguir entre las fuentes respiratorias y glucolíticas de acidificación extracelular.

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Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.

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El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

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Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

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Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal

Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

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