Name: Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de Drosophila melanogaster durante la etapa pupal mediante microscopía confocal. Este método permite observar cambios dinámicos en células epiteliales y la formación de estructuras tipo Partenón.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes en vivo extendidas de la morfogénesis de las patas de la pupa de Drosophila sin pupario

<ol><li>Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+Drosophila+IAP1+determines+caspase+functions+in+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development.</a> J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).</li>
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<li>Ziserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J Vis Exp. (51), e2706(2011).</li>
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<li>Kojima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+mechanism+of+the+tarsus+in+insect+legs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental mechanism of the tarsus in insect legs.</a> Curr Opin Insect Sci. 19, 36-42 (2017).</li>
<li>Mirth, C., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+development+in+the+Drosophila+leg%3A+Cell+movements+and+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Joint development in the Drosophila leg: Cell movements and cell populations.</a> Dev Biol. 246 (2), 391-406 (2002).</li>
<li>Mirth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysteroid+control+of+metamorphosis+in+the+differentiating+adult+leg+structures+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecdysteroid control of metamorphosis in the differentiating adult leg structures of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 278 (1), 163-174 (2005).</li>
<li>Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shape+changes+of+ECM-producing+cells+drive+morphogenesis+of+ball-and-socket+joints+in+the+fly+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg.</a> Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).</li>
<li>Hiraiwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+cell+dynamics+during+the+final+shape+formation+of+the+tarsus+in+Drosophila+adult+leg+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging.</a> Dev Genes Evol. , (2024).</li>
<li>ImageJ plugin page. , Signaling RIKEN. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/">https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/</a> (2024).</li>
<li>Pandey, R., Heidmann, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+re-organization+and+dynamics+of+progression+through+mitosis+in+Drosophila+separase+complex+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial re-organization and dynamics of progression through mitosis in Drosophila separase complex mutants.</a> J Cell Sci. 118 (4), 733-742 (2005).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>35 mm/plato base de vidrio</td><td>IWAKI</td><td>3911-035</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas limpiadoras</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de #3c Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de mosca: His2Av-mRFP, sGMCA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59023</td><td></td></tr><tr><td>FV3000</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>microscopio confocal invertido</td></tr><tr><td>FV31S-SW</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>software para FV3000</td></tr><tr><td>G40L</td><td>Shin-Etsu Grasa</td><td></td> de <td>silicona</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass 18 x 18 mm 0,13-0,17 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Micro Portaobjetos Vidrio 76 x 26 mm 0.9-1.2 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>S7213</td><td></td></tr><tr><td>NEO-SABLE Tamaño 0 redondo, fino</td><td>Pincel Pentel</td><td>XZBNR-0</td><td></td></tr><tr><td>SIL300CS-30CC Aceite de</td><td>silicona</td><td>EVIDENT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscopio estereoscópico SZX7</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Terumo 50 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-50ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva transparente de doble cara</td><td>Scotch&nbsp;</td><td>665-1-12</td><td>Dado que la capa interna tiene una adherencia más fuerte que la capa externa, la capa interna debe usarse para fijar las pupas.</td></tr><tr><td>Lente de inmersión de silicona</td><td></td><td></td> UPLSAPO10x EVIDENT UPLSAPO40XS EVIDENT <td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - 2,5 mm Cutting Edge Fine</td><td>Science Tools</td><td>15000-08</td><td>opcional</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de drosophila después de la extracción del pupario

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Aquí, se describe un ejemplo de imágenes en vivo de 44 horas de la pata adulta de Drosophila en desarrollo en la etapa de pupa. Las moscas que expresan His2Av-mRFP17 (núcleos de marcado) y sGMCA18 (proteína de unión a actina marcada con GFP Moesin, actina de marcado) se recolectaron en la etapa de pupa blanca y se incubaron durante 15 h a 25 °C. El pupario se retiró y se montó de acuerdo con el protocolo (Figura 2). Se obtuvieron con éxito imágenes de pila Z del tarso y el pretarso, cerca de la punta de la pata, cada 15 min de 16 h a 60 h de APF a temperatura ambiente (no estricta, pero cercana a 25 °C). La primera mitad de la serie de imágenes se muestra en la Figura 3, la segunda mitad en la Figura 4 y la película de todo en la Película 1. A medida que el tejido de la pierna se estrechaba rápidamente, las células epiteliales formaron transitoriamente una estructura intrigante, la estructura similar al Partenón, caracterizada por sus proyecciones apicobasales y conexiones basales (Figura 3). La reducción del grosor epitelial se observó incluso después de que el contorno estaba casi terminado (Figura 4). Todo el proceso se describe en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig1.jpg"> 
Figura 1: Resumen de la formación de la forma final del tarso adulto de Drosophila durante la etapa de pupa. Todo el proceso se dividió en cinco etapas basadas en los cambios morfológicos tanto a nivel tisular como celular observados en experimentos de imágenes en vivo a largo plazo. En el lado izquierdo se muestran fotos representativas o imágenes renderizadas en superficie (señal sGMCA) correspondientes a varios puntos de tiempo. En el lado derecho se escriben breves descripciones de los eventos en cada etapa. Esta figura ha sido modificada a partir de Hiraiwa et al.15. Véase también Película 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig2.jpg"> 
Figura 2: Extracción del pupario y montaje del montaje para la obtención de imágenes en vivo. (A) Una pupa blanca recogida en un plato. (B) La pupa apareció en (A) después de incubar durante 15 h a 25 °C. La región coloreada cian indica el opérculo. (C) Una fotografía que muestra una pupa adherida a un trozo de cinta adhesiva de doble cara. (D-J) Serie de imágenes que muestran el procedimiento de extracción del pupario. (D) El opérculo se levanta con fórceps. (E) Se extirpa el opérculo. (F) Se inserta una punta de pinza entre la cutícula de la pupa y el pupario. (G) El pupario está parcialmente abierto. (H) Se vuelve a insertar la punta de un fórceps. (I) El pupario se abrió, dejando solo una pequeña porción del extremo posterior. (J) La pupa siendo levantada por un pincel. (K) Un ejemplo de fuga de líquido corporal de la pupa. El líquido que sale de la herida pinchado por la punta de un fórceps se indica con una punta de flecha. (De izquierda a derecha) Imágenes e ilustraciones que muestran el montaje de la montura. (L) Una imagen vista desde el lado superior que muestra pupas colocadas y agua destilada en el fondo de un plato con fondo de vidrio. (M) El plato después de la finalización del ensamblaje del montaje. Se colocó grasa de silicona a lo largo del borde alrededor de la parte de vidrio y se colocó un cubreobjetos sobre la grasa para sellarla. (N) Dibujo esquemático del conjunto de montaje de la pupa de Drosophila para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo. (O) Una pupa montada se desarrolló casi adulta. (P) Una pupa montada que se cierra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig3.jpg"> 
Figura 3: Cambios dinámicos de forma en las células epiteliales del tarso en 16-27,5 h de APF. (A) Una ilustración de la pupa vista desde el lado ventral. El rectángulo discontinuo corresponde a la región observada en (B-E). L1: primera pata, L2: segunda pata, L3: tercera pata. (B,C,D,E) Fotogramas de las imágenes en vivo de la parte distal del tarso en la mosca expresiva sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta). El tejido se estrecha rápidamente y la hendidura de las regiones articulares progresa. (B',C',D',E') Ampliación de las regiones rodeadas por las líneas discontinuas en (B,C,D,E), respectivamente. La flecha y la punta de flecha en (C') muestran un ejemplo de proyecciones apicobasales y la posición de las conexiones basales, respectivamente. La estructura similar al Partenón comienza a formarse en (B'), está completamente formada en (C'), comienza a desaparecer en (D') y se vuelve difícil de ver en (E'). La distal está a la derecha y la dorsal a la parte superior en todas las figuras. Las etapas se muestran en las esquinas inferiores derechas en (B,C,D,E). Barras de escala: B, C, D, E: 50 μm; B',C',D',E': 10 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Hiraiwa et al.15. Véase también Película 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig4.jpg"> 
Figura 4: Cambios de forma en la capa de células epiteliales tarsales en 41-60 h APF. (A,B,C,D) Imágenes fijas del mismo conjunto de datos secuenciales de imágenes en vivo que la Figura 3. Los rectángulos discontinuos en (A,B,C,D) se amplían en (A',B',C',D'), respectivamente. Alrededor de las 48 h APF (A-B'), la formación de formas externas, como el alargamiento de cerdas, garras y pulvillos, está casi completa. La parte inferior de la articulación invaginada se movió proximalmente y, a continuación, la formación de la estructura esférica progresó después de unas 54 h de APF. La diferencia morfológica entre el epitelio dorsal y ventral se hizo evidente (flechas dobles y flechas dobles abiertas en B',C',D'). Después de 54 h APF (C-D'), la capa epitelial disminuyó su espesor sin apenas cambiar el contorno de los segmentos. La dorsal está hacia arriba y la distal hacia la derecha en todas las figuras. Barras de escala: A, B, C, D: 50 μm; A',B',C',D': 20 μm.Esta cifra ha sido citada de Hiraiwa et al.15. Véase también Película 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig5.jpg"> 
Figura 5: Un ejemplo de la observación de la pierna utilizando la función Bright Z. (A,B) Imágenes de la región, profundidad y etapa correspondientes de la tercera pata de la mosca que expresa sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta), con (B) o sin (A) usando la función Bright Z. (A) Un plano XY a 59,1 μm de profundidad extraído de la observación de la región tarsiana en la tercera pata a 16 h APF adquirida sin utilizar la función Bright Z. (A') La vista transversal corresponde a la línea vertical amarilla de (A). La línea vertical en (A') indica el plano focal de (A). (B) Un plano XY a 61,6 μm de profundidad extraído de la observación de la región tarsiana en la tercera pata a 16 h APF adquirida utilizando la función Bright Z. Se ajustaron tanto el voltaje PMT como la potencia del láser. La visibilidad de la imagen mejora en comparación con (A). (B') La vista en sección corresponde a la línea vertical amarilla de (B). La línea vertical amarilla en (B') indica el plano focal de (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Un ejemplo de la configuración del microscopio confocal para obtener imágenes en vivo de la región tarsiana de la pierna de 15 a 30 h APF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Película 1: Imagen en vivo a largo plazo de la parte distal del tarso durante 44 h. Se utilizaron las moscas expresivas sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta). El plano XY más representativo se extrajo del mismo conjunto de datos que la Figura 3 y la Figura 4. Las puntas de flecha indican ejemplos de futuras regiones conjuntas. Las células que se mueven rápidamente en el tejido son células similares a los macrófagos. La señal en forma de cuerda que se extiende a lo largo de los segmentos del tarso es parte del tabique. La marca de tiempo muestra hh: mm. La distal está a la derecha y la dorsal hacia arriba. Esta película ha sido adaptada de Hiraiwa et al.15<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/Movie%201.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

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Investigación

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Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

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En este video, se describe un método para obtener imágenes de células vivas de la división asimétrica sensorial células progenitoras de órganos y células de la epidermis intacta...

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En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

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A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Aquí, presentamos un método fácil de usar y versátil para realizar en proyección de imagen de procesos de desarrollo en general y músculo-Tendinosas de la morfogénesis en particular en la vida de pupas de Drosophila .

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

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