Name: Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende la técnica de electroporación en organoides corticales humanos cortados para manipulación génica. Este método permite estudiar la función de genes en el desarrollo cortical y trastornos neurodesarrollo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Eliminación del gen CRISPR/Cas9 en organoides corticales humanos cortados mediante electroporación

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga PP de 15 mL, cónicos</td><td>Unidad central Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Unidad Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X</td><td>Tubo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fondo redondo de poliestireno de 5 mL con tapa de filtro de celdas</td> Placa de 6 <td>pocillos</td><td>Corning Falcon 352235</td><td></td></tr>, <tr><td>tratada con nunclon</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>para hiPSC Placa de cultivo</td></tr><tr><td>de 6 pocillos, fijación ultra baja</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Para cultivo de organoides</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Medio de prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Compresor de aire</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Burro Anti-Pollo IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Anticuerpo secundario, RRID: AB_2340375; dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticuerpo secundario, RRID: AB_162543; dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>Diseño personalizado (pedido como 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1081060</td><td>100 y micro; g, de Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Medio del prosencéfalo 2, 3 y 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-GFP (pollo, policlonal)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; dilución 1:2000</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario anti-PCGF4 (ratón, monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; dilución 1:300</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Medio prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-suplemento (+ vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Medio prosencéfalo 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Kit de cable de plátano a microagarrador</td><td>Aparato Harvard BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Termociclador (máquina de PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capilares, vidrio de borosilicato con filamento, diámetro exterior 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm de longitud</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>Necesita ser estirado hasta un grosor específico</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Medio de prosencéfalo 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Planta de ingeniería de células madre en CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Línea hiPSC adaptada a una sola célula del donante</td></tr><tr><td>sano DAPI</td><td>Roche 10236276001</td><td></td><td>1 mg/mL de stock, uso diluido 1:1000 para</td></tr><tr><td>IF Dibutiril-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Medio del prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Medio de prosencéfalo 1, 2 y 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Medio de prosencéfalo 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas, rectas, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema de electroporación de onda cuadrada</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr> Suero fetal bovino (FBS) <tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F7252</td><td></td></tr> (<tr><td>FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Para la extracción de microcapilares</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software versión 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleótidos subrayados = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Medio prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>este documento</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponde a las imágenes KO en la Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>este documento</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponde al KO imágenes en la Figura 3I + J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>hecho en casa</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Horse Serum, Gibco 26050088</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inactivado por calor Proteína recombinante GDNF humana</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Medio de prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Humano/Ratón/Rata BDNF Proteína Recombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-02</td><td>Medio de prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Para hacer TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (cera)</td><td>Pluma Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Medio del prosencéfalo 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero Knockout Reemplazo</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Medio prosencéfalo 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscopio confocal 980</td><td>Agarosa de</td> bajo punto de fusión Zeiss<td></td><td></td></tr><tr><td>, ultrapura</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td><td>para la inclusión de hCOs durante el seccionamiento por vibratomo</td></tr><tr><td>Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal, sin LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Para el cultivo</td></tr> <tr><td>de organoidesMatrigel Matriz con calificación hESC, sin LDEV</td><td></td><td>354277</td><td>Corning para cultivo hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1 M</td> Microinyector <td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump + Interruptor de pie</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Puntas de pipeta 0.5 a 20 &; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para la carga de capilares de vidrio</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Medio de células madre</td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Medio de prosencéfalo 2 y 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Neubauer</td><td>Marca</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Medio prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Medio de prosencéfalo 1, 2, 3 y 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>tampón dúplex sin nucleasas</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Medio de inclusión para muestras de tejido congelado</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Molde de inclusión truncadoT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Para la inclusión de hCOs para vibratomo y crioseccionamiento</td></tr> de <tr><td>penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Prosencéfalo medio 1, 2, 3 y 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 y para medio de células madre después de la nucleofección</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm x 15 mm, sin ventilación, estéril</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td>Placa de</tr><tr><td>Petri Cámara de electrodos de platino, espacio de 5 mm</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td> <td>hecha en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>De Titrachium album; 10 mg/mL stock</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la vía RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Medio prosencéfalo 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus correderas de adherencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 con un KL 300 LED</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>O estereoscopio alternativo</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>a.k.a. Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Para hacer TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Disociation enzmye para hacer suspensiones unicelulares</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polisorbato 20</td></tr><tr><td>Sal de Tiro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Vibrador Microtomo (vibrátomo)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &micro; L Puntas de filtro de ajuste universal</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Medio prosencéfalo 1, 3 y 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

La ablación génica mediada por CRISPR/Cas9 requiere el diseño de ARNg. En general, dirigirse a uno de los primeros exones de un gen de interés con un par de ARNg espaciados entre 7 y 11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) funciona bien (Figura 1A). Como primera prueba, la eficiencia del reconocimiento de plantillas por parte de los ARNg puede ser interrogada in vitro utilizando una plantilla de PCR 26,40,62. La focalización eficiente y el corte mediado por Cas9 son visibles en la reducción del ADN molde y la aparición de productos de ADN escindidos en un gel de agarosa (Figura 1B). Se pueden realizar más pruebas de ARNg en la línea iPSC que se utiliza para la generación de organoides corticales. Esto requiere la nucleofección de iPSCs, que se puede visualizar mediante la expresión exitosa de un reportero fluorescente (Figura 1C). La focalización eficiente del locus de interés puede verificarse mediante la secuenciación de Sanger, lo que da como resultado un cromatograma que termina abruptamente o se superpone alrededor del sitio de focalización (Figura 1D), como resultado de un espectro de indels de la reparación de rotura de doble cadena por unión de extremos no homólogos66. Las pruebas de eficiencia del ARN guía in vitro y en células iPSC ayudan a la selección de pares de ARNg eficientes para la ablación de genes en organoides corticales.
Antes de la electroporación, se cortan los organoides corticales, lo que apoya la identificación de los lúmenes de los ventrículos para la inyección de la mezcla de electroporación (Figura 2A-C). A continuación, los organoides inyectados se transfieren a la cámara de electroporación (Figura 2D). Para la electroporación, se deben utilizar organoides corticales con estructuras ventricles bien desarrolladas (Figura 2E), mientras que los organoides corticales que carecen de estructuras visibles deben descartarse (Figura 2F). La mezcla de electroporación contiene un tinte que permite la visualización de los ventrículos inyectados durante el procedimiento (Figura 2G). Después de 1-3 días en cultivo, los ventrículos dirigidos con éxito son visibles por la señal GFP nativa bajo un microscopio fluorescente (Figura 2H).
Para el análisis histológico en profundidad, se puede realizar la inmunohistoquímica de las criosecciones. Idealmente, múltiples ventrículos dirigidos están presentes dentro de un organoide cortical electroporado (Figura 3A,B). Las electroporaciones más óptimas se dirigen a estructuras similares a ventrículos en la región externa del organoide que mira hacia el exterior (Figura 3C), ya que estos suelen ser los ventrículos más expandidos. En algunos casos, la electroporación puede conducir a una muerte celular excesiva (Figura 3D, E), por ejemplo, cuando las concentraciones de plásmidos son demasiado altas o los ajustes de electroporación no son óptimos. Las electroporaciones que miran hacia el interior del organoide (Figura 3F) a menudo involucran regiones menos expandidas de las estructuras similares a ventrículos en comparación con el exterior. En nuestra experiencia, es útil centrar el análisis cuantitativo en regiones definidas del organoide para reducir la variabilidad. A veces, la electroporación puede causar alteración de la superficie apical (Figura 3G), por ejemplo, cuando el volumen de inyección es demasiado alto, lo que provoca la ruptura de los ventrículos, o cuando los pulsos eléctricos son demasiado fuertes, lo que provoca la delaminación de las células. Por último, cuando se dirigen dos ventrículos adyacentes (Figura 3H), puede resultar difícil asignar los límites de las zonas corticales y el origen de las células objetivo.
La inmunohistoquímica puede utilizarse para verificar el éxito de la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 a nivel de proteína en células de interés (Figura 3I), ejemplificada aquí dirigiéndose a la proteína PCGF467 del Complejo Represivo Polycomb 1 (PRC1). La intensidad de la señal puede analizarse en células positivas para GFP en condiciones de control frente a experimentales (Figura 3J). Alternativamente, si no se dispone de un anticuerpo adecuado, las células diana pueden aislarse mediante FACS a partir de organoides corticales60 y analizarse posteriormente mediante Sanger o Next Generation Sequencing36. Además, la reducción de los niveles de proteínas también puede analizarse mediante Western blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Diseño y validación de ARN guía para el knockout agudo de genes mediado por CRISPR/Cas9. (A) Ilustración esquemática de la estrategia de diseño de ARN guía (ARNg), con dos ARNg dirigidos a un exón de un gen de interés. Las flechas negras indican los cebadores de PCR para la preparación de plantillas utilizados para la validación de ARNg. (B) Validación de la eficiencia del ARNg in vitro. Las plantillas amplificadas por PCR se digierieron con complejos RNP. Tras una escisión exitosa, dos bandas de diferentes tamaños son visibles después de la electroforesis en gel (izquierda), mientras que la plantilla permanece sin cortar para los ARNg de baja eficiencia (derecha). (C) Imagen de campo claro (izquierda), fluorescencia GFP (centro) e imágenes fusionadas (derecha) de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) 3 días después de la nucleofección con el complejo RNP y un plásmido GFP. Barras de escala: 350 μm. (D) Validación de la eficiencia del ARNg en hiPSCs mediante secuenciación de Sanger de ADN amplificado de células GFP positivas. Tras la escisión exitosa del ADN bicatenario, las pistas de secuenciación muestran señales superpuestas a partir del sitio objetivo del ARNg (arriba, KO1). En el caso de una selección infructuosa, el seguimiento de la secuencia de ADN permanece sin cambios (abajo, KO2) en comparación con el control LACZ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas. (A) Ilustración esquemática que muestra el flujo de trabajo para la electroporación de organoides corticales humanos (hCOs). En primer lugar, los hCO se dividen en rodajas de 500 μm de grosor. Dos días después, la mezcla de RNP que contiene un plásmido de expresión de GFP y Fast Green se inyecta en los lúmenes de las estructuras similares a los ventrículos, preferentemente en la región externa de los hCO. Para la electroporación, los hCOs se colocan en la cámara de electroporación. Después de varios días de cultivo, se puede detectar una señal GFP en áreas electroporadas. (B) Imágenes del corte en vibratomo de los hCOs. Los organoides están incrustados en agarosa de bajo punto de fusión al 3% en un medio en un bloque (izquierda). El bloque se secciona en rodajas de 500 μm de grosor (centro). Los organoides cortados en rodajas se transfieren de nuevo a la placa de cultivo con una punta de pipeta de diámetro ancho (derecha). (C) Imágenes que muestran la inyección de la mezcla que contiene RNP, pCAG-GFP y 0.1% Fast Green en estructuras ventrículas de los organoides. Los organoides se sumergen en la solución de Tyrode y el capilar de vidrio delgado se inserta en la luz del centro de las estructuras similares a ventrículos (izquierda). Se utilizan pinzas para estabilizar los organoides (izquierdo y medio). Los ventrículos en el exterior de los organoides son dirigidos (centro). Los organoides inyectados se transfieren a la cámara de electroporación, o posteriormente a la placa de cultivo, con puntas de pipeta de diámetro ancho (derecha). (D) Imágenes de la cámara de electroporación, que está formada por una placa de Petri de vidrio y dos cuchillas de metal que están pegadas al vidrio. Las cuchillas metálicas sirven como electrodos y contienen orificios para sujetar los cables que se conectan al electroporador. El lado inyectado del hCO, visible a través de una sombra verde, debe mirar hacia el ánodo (polo positivo, cable rojo) (derecha). (E) Imágenes representativas de hCOs que muestran estructuras ventrículas bien desarrolladas. El anillo más claro representa el área similar a la zona ventricular. El círculo más oscuro en el centro de la estructura similar a un ventrículo representa la luz y debe ser el objetivo de la inyección. (F) Imágenes representativas de hCOs que carecen de estructuras similares a ventrículos bien desarrolladas, que recomendamos no incluir para futuros experimentos. (G) Imágenes representativas de hCOs después de la inyección de la mezcla de electroporación, en las que las áreas objetivo son visibles por Fast Green (flechas naranjas). (H) Imagen representativa de hCO que muestra la señal GFP nativa 24 h después de la electroporación. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
Figura 3: Análisis inmunohistoquímico de organoides corticales humanos electroporados en rodajas. (A) Esquema que representa un organoide cortical humano electroporado (hCO) con señal fluorescente verde. (B) Tinción de DAPI (gris) e inmunofluorescencia para GFP (verde) de un hCO crioseccionado con múltiples ventrículos electroporados, 7 días después de la electroporación. (C-H) Imágenes de ejemplo de diferentes resultados de electroporación, teñidas para GFP (verde) y núcleos (DAPI, gris). (C) Una electroporación óptima con núcleos intactos (ver inserto 1, D), una estructura similar a un ventrículo ininterrumpida y células electroporadas en el área que mira hacia el exterior del organoide, que generalmente está más expandida. (E) Ejemplo de hCO que muestra muerte celular masiva en el área electroporada (véase también el inserto 2, D), caracterizado por núcleos pequeños, densos en DAPI y distorsionados. (F) Una electroporación exitosa dirigida hacia el interior del organoide, que a menudo es más difícil de interpretar debido a las áreas en forma de placas corticales que se fusionan con los ventrículos adyacentes. (G) Estructuras similares a ventrículos alteradas en el centro del área electroporada (flecha naranja). (H) Un ejemplo de hCO que contiene múltiples ventrículos más pequeños que están parcialmente fusionados y, por lo tanto, son difíciles de cuantificar. (I) Tinción de DAPI (gris) e inmunofluorescencia para GFP (verde) y PCGF4 (magenta) 7 días después de la electroporación de un complejo RNP dirigido a LACZ (gLACZ KO, izquierda) o PCGF4 (gPCGF4 KO, derecha) para el knockout mediado por CRISPR/Cas9. Las células encerradas en un círculo resaltan la intensidad reducida de PCGF4, lo que indica una ablación génica exitosa. Se puede ver una señal uniforme en el control LACZ (izquierda). (J) El gráfico muestra la intensidad cuantificada de PCGF4 después de la inmunofluorescencia en células GFP positivas para el control (gLACZ KO) y el KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) en relación con la expresión media de PCGF4 en la condición gLACZ. Cada punto representa una celda. Datos de 3-4 organoides de dos lotes diferentes (gris y negro) de la misma línea hiPSC. p &lt; 0,0001, prueba de Mann-Whitney. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal (B, C) o fluorescente (E-I) de barrido láser. Las imágenes representan proyecciones de máxima intensidad de pilas z de 10-15 μm de grosor. Las líneas discontinuas blancas indican la superficie apical frente a la luz del ventrículo y las superficies externas de los hCO. Las líneas discontinuas de color naranja indican el borde VZ/SVZ en los ventrículos fusionados. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticuerpo/Tinte</td>
			<td>Dilución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollo anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratón anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Burro Anti-Pollo</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Burro Anti-Conejo</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1 mg/mL de caldo; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Lista de anticuerpos y colorantes y su dilución utilizados para la tinción con inmunofluorescencia.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Electroporación de una sola célula en cultivos organotípicos de cortes de cerebro: una técnica in vitro para administrar plásmidos dentro de neuronas específicas en cortes de hipocampo cerebral

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que...

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Aprende la técnica de electroporación en organoides corticales humanos cortados para manipulación génica. Este método permite estudiar la función de genes en el desarrollo cortical y trastornos neurodesarrollo.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

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