Fenotipado basado en purificación, expansión y citometría de flujo de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de ratón

Nuestra investigación proporciona un método de bajo costo para purificar y expandir células madre mesenquimales homogéneas de médula ósea de ratón. Esto ayuda a los investigadores a obtener suficientes células de alta calidad con fuertes capacidades de crecimiento y diferenciación. Un desafío clave en la investigación con células madre de médula ósea es desarrollar un protocolo sencillo y efectivo para aislar las células madre mesenquimales de la médula ósea. Este método permite que las células madre mesenquimales de la médula ósea crezcan lateralmente evitando alteraciones. Utiliza un tercer paso, evita efectos de crecimiento adicionales y mantiene las células hematopoyéticas para apoyar la salud y la función de las células madre.

[Instructor] Para comenzar, remoje el ratón sacrificado en etanol al 75% durante cinco minutos. Con unas tijeras de disección estériles, haga una incisión de aproximadamente un centímetro en la extremidad posterior, cerca del tendón de Aquiles. Luego, realice una incisión circular alrededor de la extremidad posterior para exponer la tibia distal. Pele la piel desde el sitio de la incisión hacia arriba hacia la cadera para quitar la piel de ambas extremidades traseras. Corte a lo largo del hueso ilíaco para separar la cabeza femoral del hueso de la cadera. Con un bisturí estéril, extraiga la mayor cantidad posible de tendón y músculo de la tibia y el peroné para facilitar el enrojecimiento posterior. Regrese los huesos limpios al plato que contiene PBS con penicilina y estreptomicina al 2% antes de moverlos a una campana estéril. Tome una jeringa de 50 mililitros y conecte la aguja que viene con la jeringa. Llene la jeringa con 20 mililitros de medio alfa MEM y reemplace la aguja con la que viene con la jeringa de un mililitro. En la capucha estéril, use unas tijeras para cortar ambos extremos del fémur o la tibia separados. Ahora, inserte la aguja en el hueso en el borde cortado y enjuague la médula ósea en una placa de cultivo celular de 100 milímetros que contenga medio alfa MEM completo. Continúe enjuagando hasta que el hueso se vuelva visiblemente pálido, lo que indica una extracción exitosa de la médula. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 40 veces con una punta de pipeta de un mililitro para dispersar los agregados celulares. Ahora, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros en un tubo centrífugo de 50 mililitros para eliminar los desechos, los fragmentos de tejido y los grumos no dispersos. Ajuste el volumen total a 15 mililitros con medio alfa MEM completo y transfiera la suspensión celular filtrada a una placa de cultivo de 100 milímetros. Sostenga el plato con ambas manos y gírelo suavemente 15 veces en un movimiento en forma de ocho para distribuir las células uniformemente por todo el plato. Finalmente, coloque la placa de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados y cultive durante cinco días. Esta figura ilustra la progresión morfológica de las células estromales de la médula ósea desde la extracción inicial hasta el tercer paso en cultivo. Las células de médula ósea recién extraídas parecían predominantemente mononucleares con gotas de grasa dispersas visibles en todo el campo. Al quinto día de cultivo, las células en forma de huso comenzaron a emerger y alcanzaron aproximadamente un 60% a un 80% de confluencia, continuando aumentando su densidad al séptimo día. Desde el pasaje uno hasta el pasaje tres, las células estromales de la médula ósea mantuvieron una morfología fusiforme o fusiforme, formaron una monocapa clara con colonias interconectadas y no mostraron signos de apoptosis como granularidad citoplasmática o fragmentación nuclear. La citometría de flujo confirmó que CD29, CD44 y Sca-1 estaban altamente expresados en las células estromales de la médula ósea. La expresión de los marcadores CD31 y CD45 de linajes endoteliales y hematopoyéticos fue insignificante. La cuantificación de marcadores confirmó además los altos niveles de expresión de CD29, CD44 y Sca-1 en comparación con CD31 y CD45.