Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

El accidente cerebrovascular isquémico es la principal causa de muerte y discapacidad en todo el mundo. Nuestro trabajo se centra en las dianas farmacológicas para el ictus. Estamos interesados en varios objetivos emergentes, como RUNX1 y catepsinas. Para evaluar estos objetivos, desarrollamos un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico mediante la oclusión de la arteria cerebral media.

Modelamos el accidente cerebrovascular isquémico en ratas insertando un filamento para ocluir la arteria cerebral media. El modelo de oclusión de la arteria cerebral media es el modelo de roedores más utilizado para estudios preclínicos de accidente cerebrovascular combinado con otras técnicas, como TTC, inmunofluorescencia y tinción TUNEL. Podemos explorar la fisiopatología del accidente cerebrovascular en un enfoque integrado. Existen algunos desafíos técnicos para la inmunofluorescencia, como la especificidad de los anticuerpos que minimizan el fondo de fluorescencia y optimizan la relación señal-ruido al aprovechar las propiedades de las etiquetas fluorescentes y los anticuerpos específicos. La inmunofluorescencia nos permite comprender el intrincado panorama de la arquitectura celular y las interacciones moleculares con el modelo de oclusión de la arteria cerebral media.

Una cantidad de tejido cerebral es potencialmente recuperable con una ventana de tiempo adecuada del accidente cerebrovascular. Nuestros resultados muestran que la expresión de catepsina B se activa en el número de cerebros de ratas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Se acompaña de un aumento de la apoptosis. Más estudios sobre el mecanismo subyacente a la señalización de la muerte celular pueden ser un nuevo objetivo para el fármaco.

En nuestro estudio futuro, continuaremos explorando posibles objetivos moleculares en las vías inflamatorias y la señalización de la muerte celular. Esperamos que algunos de estos objetivos descubiertos por estudios experimentales puedan traducirse en terapia clínica, mejorando así la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con accidente cerebrovascular.

[Narrador] Para comenzar, coloque a la rata anestesiada en posición supina y mantenga su temperatura corporal a 36,5 ° C utilizando una estera térmica regulada y una sonda de monitor de temperatura rectal. Afeitar la piel del cuello y desinfectarla con una solución desinfectante de yodóforo. A continuación, haga una incisión de 2 cm en la línea media del cuello y retraiga los tejidos blandos para exponer los vasos carotídeos. Con fórceps, aísle la arteria carótida común derecha, o CCA, la arteria carótida externa, ECA y la arteria carótida interna, ICA. Ligue el CCA proximal derecho con suturas. A continuación, sujete el ICA y el ECA correctos en su origen con un microclip. Inserte un monofilamento de nailon recubierto con una punta redonda de silicona en la luz del CCA a través de una pequeña incisión y haga un nudo en el CCA para evitar el sangrado y el desprendimiento del monofilamento. Abra el microclip ICA derecho e inserte el monofilamento en la arteria cerebral media derecha, o MCA, a través del muñón ICA hasta que la punta de silicona ocluya el origen del MCA. Corta la parte expuesta del monofilamento de nailon y cierra la incisión de la línea media del cuello. Después de dos horas de oclusión de MCA, abra la incisión del cuello y desate el nudo en el CCA. Luego retire el monofilamento de nylon para reperfundir el MCA. Después de la cirugía, observe a la rata durante la recuperación de la anestesia en una jaula calentada mantenida con una estera calefactora de temperatura regulada. Usando la Escala de Calificación de Comportamiento Zaya Long, evalúe la función neurológica dos horas después de la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAO, y 22 horas después de la reperfusión. Después de aislar todo el cerebro de la rata modelo MCAO, congele el cerebro a -20 ° C durante 20 minutos. Corta el cerebro congelado en seis rodajas coronales con una distancia de 2 mm entre las rodajas. Tiñe las rodajas con TTC al 2% durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad. Luego fije las rodajas de cerebro con paraformaldehído al 4% durante 24 horas a temperatura ambiente. Fotografíe las rodajas manchadas con una cámara digital configurada en modo automático para objetos de primer plano. Transfiera las imágenes a una computadora y use el software ImageJ para medir el tamaño del infarto. Calcule el tamaño del infarto como la relación entre la suma del área del infarto en los seis cortes y la suma del área total del cerebro en los mismos cortes. Se observaron áreas de infarto significativas en el grupo MCAO en comparación con ningún infarto en el grupo simulado. Para el análisis de inmunofluorescencia, fije el cerebro intacto de la rata modelo MCAO en paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Luego deshidratar el cerebro en una serie de gradientes de solución de sacarosa a concentraciones del 10%, 15% y 30%, al 10%, 15% y 30%, continuando hasta que el tejido se hunda. Incruste el cerebro deshidratado en un compuesto de temperatura de corte óptima y elimine las burbujas de aire. Congele el cerebro en nitrógeno líquido. En un criostato, secciona el cerebro a un grosor de 5 μm. Después de equilibrar las secciones cerebrales congeladas a temperatura ambiente, lávelas tres veces con PBS estéril durante 5 minutos cada una. Delinee el tejido con una pluma de inmunohistoquímica antes de incubar con 20 μg por ml de proteinasa K y Triton X-100 al 0,3% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de lavar las secciones con PBS, aplique BSA al 3% al tejido delineado e incube a temperatura ambiente durante una hora para bloquear. Reemplace la solución de bloqueo con el anticuerpo primario apropiado e incube las secciones durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. Al día siguiente, lave las secciones tres veces con PBS estéril que contenga 0.1% Tween-20 durante 5 minutos cada una. Agregue el anticuerpo secundario apropiado conjugado al fluoróforo requerido e incube las secciones en una cámara humidificada durante una hora, protegiéndolas de la luz. Después de lavar las secciones con PBS que contienen Tween-20, tiñirlas con un medio de montaje que contenga DAPPI y cubrirlas con cubreobjetos. En un microscopio de fluorescencia, establezca la longitud de onda de excitación en 488 nm, la longitud de onda de emisión en 520 nm y el tiempo de exposición en 500 ms para capturar la sección cerebral teñida imEdades. La inmunorreactividad de la catepsina B aumentó significativamente en el núcleo isquémico del grupo MCAO en comparación con el grupo simulado. La inmunorreactividad de la catepsina B se elevó significativamente en la corteza de la penumbra del grupo MCAO en comparación con el grupo simulado. No se observaron diferencias significativas en la inmunorreactividad de la catepsina B entre el núcleo isquémico y la corteza penumbral. Para comenzar, deshidrate las rodajas de cerebro fijas de paraformaldehído de la rata modelo MCAO en una concentración de etanol creciente durante 35 a 50 minutos cada una. Luego trate las rodajas de cerebro con el agente biológico transparente tipo aceite de trementina 1 durante 35 a 50 minutos, seguido de agente aclarante 2 durante 35 a 50 minutos hasta que el tejido esté completamente transparente. Ahora sumerja las rebanadas cerebrales en los medios de incrustación 1, 2, 3 y 4 secuencialmente durante 60 minutos cada uno. Coloque las rodajas de cerebro en un casete de incrustación, séllelas herméticamente y guárdelas en cámaras frigoríficas para su solidificación. Con el micrótomo, recorte el bloque de tejido a 10 μm y luego córtelo a 5 μm. Deje que las secciones de tejido floten en un baño de agua a 45 ° C durante 30 segundos y luego transfiéralas a portaobjetos. Después del secado, desparafina las secciones del cerebro en un agente de limpieza durante dos ciclos de 10 minutos cada uno. Luego rehidrate las secciones del cerebro en concentraciones decrecientes de etanol. Ahora enjuague la sección tres veces en PBS durante cinco minutos cada una. Después de eliminar el exceso de humedad, agregue 100 μL de proteinasa K a cada sección e incube a 37 ° C durante 20 minutos. Después de los lavados con PBS, aplique 100 μL de tampón de equilibrio de desoxinucleotidiltransferasa terminal a cada muestra e incube en una cámara humidificada a 37 °C durante 10 a 30 minutos. Retire el tampón con papel absorbente y agregue 50 μL de solución de trabajo de etiquetado del kit de ensayo TUNEL. A continuación, aplique la solución de trabajo DAPPI a las secciones e incube en la oscuridad durante cinco minutos para contrateñir los núcleos. Enjuague las muestras en PBS cuatro veces durante 5 minutos cada una. Elimine el exceso de líquido y selle la corredera con un medio de montaje antidecoloración. Escanee el portaobjetos teñido con el sistema de imágenes multiespectrales Vectra Polaris. La tinción TUNEL mostró un aumento significativo de la apoptosis, con más células positivas para TUNEL en la corteza penumbral del grupo MCAO en comparación con el grupo simulado.