Name: Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo para estudiar fenotipos bacterianos heterogéneos en Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Este protocolo permite visualizar células persistentes y sus estrategias de supervivencia ante antibióticos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de la persistencia de antibióticos en patógenos bacterianos

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
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<li>Conlon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+chronic+and+relapsing+infections%3A+evidence+of+a+role+for+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells.</a> Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).</li>
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<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
<li>Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+bacterial+persistence%3A+Mechanisms+and+strategies+for+effective+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication.</a> ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).</li>
<li>Mempin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+ATP+by+bacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular ATP by bacteria during growth.</a> BMC Microbiol. 13, 301(2013).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).</li>
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<li>Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+physiology%2C+ecology%2C+evolution+and+clinical+importance+of+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters.</a> FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).</li>
<li>Levin, B. R., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-inherited+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-inherited antibiotic resistance.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).</li>
<li>Davis, K. M., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heterogeneity+within+bacterial+populations+via+single+cell+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches.</a> Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. 53, e3145(2011).</li>
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<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Biología Molecular Certificada Agarose</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cubreobjetos intercambiables</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>ICD de 35 mm para preparar almohadillas de agarosa; viene con cubreobjetos</td></tr> <tr><td>de 30 mm (#1.5)Motor de luz LED Lumencor Spectra 7 Motor de luz LED</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Premier versión 7.10.5</td> pco.edge <td></td></tr><tr><td>4.2 bi Cámara sCMOS</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>cámara sCMOS</td></tr><tr><td>PeCon cámara de incubación de células vivas</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific Cubreobjetos redondos, #1.5 de grosor, 25 mm, paquete de 100</td> cubreobjetos <td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25 mm (#1.5)</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Microscopio invertido con objetivo Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, motor de luz LED Lumencor Spectra 7 y cámara pco.edge 4.2 bi sCMOS (tamaño de píxel de 6,5 mm)</td></tr></tbody></table>

imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de pseudomonas aeruginosa y staphylococcus aureus

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

La introducción exitosa de plásmidos reporteros en P. aeruginosa y S. aureus está indicada por el crecimiento con los antibióticos selectivos correctos y puede confirmarse mediante PCR de colonias y/o secuenciación. Las cepas modificadas deben verificarse como reporteros fenotípicos sometiéndolas a condiciones en las que se sepa que el gen de interés está inducido, y la fluorescencia resultante puede medirse mediante citometría de flujo, espectrofotometría o microscopía de epifluorescencia (Figura 1).
Para facilitar la selección de una dosis o dosis de antibiótico que se utilizarán para experimentos posteriores, se deben realizar ensayos de persistencia de antibióticos dependientes de la concentración para las cepas de P. aeruginosa o S. aureus de interés. Los ensayos dependientes de la concentración suelen dar lugar a una curva bifásica con una pendiente inicial pronunciada a concentraciones de antibióticos más bajas y una meseta o pendiente menos pronunciada a concentraciones más altas. Sin embargo, para algunos pares de antibióticos-especies, es posible que no se produzca una curva bifásica distinta. Por ejemplo, la curva de elefloxacino de S. aureus des claramente bifásica (Figura 3A), pero la curva de levofloxacino de P. aeruginosa no lo es (Figura 3B)15. En este escenario, elegiríamos una concentración que sea al menos 10 veces la CMI (por ejemplo, 5 μg/mL, que es aproximadamente 15 veces la CMI para P. aeruginosa)15. Sin embargo, debido a que 15x levofloxacina MIC da como resultado solo ~0.001% en sobrevivientes de P. aeruginosa , usamos 1 μg / mL de levofloxacina si queremos ver persistencias al obtener imágenes de las células a medida que se recuperan en almohadillas de agarosa sin antibióticos (Video complementario 6); De lo contrario, el número de campos de visión necesarios para crear una imagen de varios persistentes se vuelve prohibitivo.
Al comienzo de la toma de imágenes, la preparación ideal de la muestra y la almohadilla de agarosa debe aparecer plana en todo el campo de visión, libre de grandes residuos, arrugas o burbujas de aire, y con células individuales distribuidas uniformemente. La obtención de células individuales bien distribuidas puede requerir la optimización de la dilución o resuspensión de la muestra. En el caso de S. aureus, las células tienden a formar pequeños grupos y necesitan ser sometidas a un vórtice minucioso antes de sembrarlas en la plataforma de agarosa (Figura 4 y Figura 5). En el caso de P. aeruginosa, las células pueden formar agregados encerrados en una matriz extracelular pegajosa en suspensión; Es necesario pipetear estas muestras a fondo y alterar los agregados para obtener imágenes de células individuales. 
Después de la conclusión de un experimento de imagen, un lapso de tiempo exitoso de imágenes aparecerá enfocado, iluminado de manera estable y con una deriva mínima en el plano x-y durante todo el experimento. El vídeo suplementario 7 representa una adquisición óptima de la imagen: t es el canal de fase del vídeo suplementario 4 antes de la corrección de la sombra o la deriva. La pérdida de enfoque puede ocurrir si la condensación (por humidificación excesiva o calentamiento insuficiente de la muestra) hace que se formen gotas de agua en el cubreobjetos superior de 25 mm, distorsionando la luz y empujando el plano focal fuera del rango de búsqueda máximo del algoritmo de enfoque automático (Video complementario 8). La variación en la iluminación generalmente indica un aceite de inmersión insuficiente en el momento de la toma de imágenes. Si el escenario se mueve demasiado rápido, el aceite del objetivo puede arrastrarse y seguir poniéndose al día cuando se adquieren las imágenes. Esto se puede mitigar ajustando los controles de adquisición para ralentizar la velocidad del movimiento o añadiendo una pausa entre el movimiento a la siguiente posición y la adquisición de la imagen. La deriva principal de la muestra se verá como muchas células que atraviesan el campo de visión, mientras que algunas permanecen en su lugar (Video complementario 9). Esto suele ocurrir más tarde en los experimentos porque la almohadilla de agarosa se ha deshidratado debido a un control insuficiente de la humedad. La preparación de la almohadilla de agarosa presentada en este documento fue diseñada para facilitar la estabilidad de la muestra, pero es necesario calentar/humidificar adecuadamente la muestra y su entorno circundante para una adquisición óptima de la imagen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg"> 
Figura 1: Cepas reporteras fluorescentes iluminan la expresión de un gen de interés. (A) S. aureus se transdució con un reportero transcripcional GFP para un gen de interés según el Protocolo 1. La cepa reportera se trató durante 24 h con antibiótico, se lavó con PBS y luego se sembró en una almohadilla de agarosa hecha de CA-MHB más yoduro de propidio (1,6 μM) y cloranfenicol (10 μg/mL para el mantenimiento del plásmido reportero) para obtener imágenes durante la recuperación (Video complementario 1). (B) P. aeruginosa se transformó con un plásmido portador de un reportero traduccional ligado a mScarlet para una proteína de interés26. La cepa reportera se trató durante 5 h con antibiótico, se lavó con PBS y luego se sembró en una almohadilla de agarosa hecha de BSM más Tet (75 μg/mL; para el mantenimiento del plásmido reportero) para obtener imágenes durante la recuperación (Video complementario 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg"> 
Figura 2: Propagación y recolección de bacteriófagos. (A) Las seis placas muestran seis cantidades diferentes de stock de fagos diluidos en el césped de S. aureus RN4220. Los contornos rojos indican las tres placas que se cosecharían, desde la placa con mayor claridad (contorno rojo en negrita; 1 x109 PFU/mL) hasta las siguientes dos diluciones (1 x108 y 1 x 107 PFU/mL). Las flechas negras apuntan a placas individuales. (B) Para recolectar el fago de las placas, raspe la capa de agar blando (izquierda), transfiera la suspensión a la siguiente placa de dilución (centro) y, después de agrupar el agar blando de las tres placas, combínelo en un tubo cónico para la centrifugación (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg"> 
Figura 3: Ensayos representativos de persistencia dependientes de la concentración. Se evaluó la persistencia de fluoroquinolonas dependiente de la concentración en (A) S. aureus (frente a delafloxacino) y (B) P. aeruginosa (frente a levofloxacino) en fase estacionaria. En experimentos posteriores se utilizaron 5 μg/mL de delafloxacino (círculo rojo) porque la matanza de S. aureus se había estabilizado en esta concentración. Se utilizaría una dosis de al menos 1 μg/mL de levofloxacino (círculo rojo) para experimentos posteriores con P. aeruginosa. Nótese que la matanza bacteriana no se estabiliza para P. aeruginosa, pero todavía hay una "segunda fase" menos pronunciada de la curva bifásica que indica una subpoblación persistente. El panel 3B ha sido adaptado con permiso de Hare et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg"> 
Figura 4: Imagen de los fenotipos bacterianos durante el tratamiento con antibióticos. Las células de S. aureus y (B) P. aeruginosa en fase estacionaria se sembraron en almohadillas de agarosa que contenían antibióticos fluoroquinolonas y se monitorearon durante el tratamiento: 5 μg/mL de delafloxacino para S. aureus (Video suplementario 3) y 5 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa (Video suplementario 4)15. Se añadió yoduro de propidio (PI; 16 μM para P. aeruginosa, 1,6 μM para S. aureus) a las almohadillas para marcar las células muertas o moribundas. Las células de S. aureus permanecen en gran medida intactas y vivas en presencia del FQ, mientras que la mayoría de las células de P. aeruginosa sufren cambios morfológicos drásticos, incluida la formación de esferoplastos redondos, antes de lisarse y morir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg"> 
Figura 5: Seguimiento de los persistentes durante la recuperación. (A) Las poblaciones de S. aureus y (B) P. aeruginosa se sembraron en almohadillas de agarosa que contenían medios frescos después de haber sido tratadas con fluoroquinolonas (5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus y 1 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa) y monitoreadas durante su recuperación posterior al tratamiento (Video Suplementario 5 y Video Suplementario 6). Las perihermanas observadas están señalizadas con flechas verdes en los dos primeros fotogramas de cada panel, y permanecieron intactas y viables durante el tratamiento antibiótico. Después de un período de retraso inicial, los persistentes comenzaron a dividirse y dieron lugar a una nueva progenie (indicada con círculos verdes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg"> 
Figura 6: Preparación de la muestra al microscopio. (A) Esquema del flujo de trabajo de preparación de muestras utilizando un plato de cubreobjetos intercambiable ("cámara"). (B) Imagen de la cámara desmontada y sus componentes individuales. (C) Imagen de la cámara completamente ensamblada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video complementario 1: S. aureus persister. Archivo de vídeo que contiene las imágenes de la Figura 1A. En resumen, S. aureus portador de un indicador transcripcional GFP para un gen de interés fue tratado durante 24 h con antibiótico, lavado con PBS, luego sembrado en una almohadilla de agarosa hecha con CA-MHB más yoduro de propidio (1,6 μM) y cloranfenicol (10 μg/mL) para la obtención de imágenes durante la recuperación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 2: P. aeruginosa persister. Archivo de video que contiene imágenes en la Figura 1B. En resumen, P. aeruginosa portadora de un reportero traslacional ligado a mScarlet para una proteína de interés fue tratada durante 5 h con antibiótico, lavada con PBS y luego sembrada en una almohadilla de agarosa hecha con BSM más Tet (75 μg/mL) para la obtención de imágenes durante la recuperación26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 3: S. aureus durante el tratamiento con antibióticos. Un cultivo en fase estacionaria de S. aureus cultivado en un medio rico químicamente definido se sembró en almohadillas de agarosa hechas con los medios acondicionados libres de células del cultivo con yoduro de propidio (1,6 μM) y delafloxacino (5 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 4: P. aeruginosa durante el tratamiento con antibióticos. Un cultivo en fase estacionaria de P. aeruginosa cultivado en BSM se sembró en almohadillas de agarosa hechas a partir de medios acondicionados libres de células de un cultivo de P. aeruginosa cultivado en BSM en paralelo; la almohadilla de agarosa también contenía yoduro de propidio (16 μM) y levofloxacino (5 μg/mL). Este video ha sido adaptado con permiso de Hare et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 5: S. aureus durante la recuperación post-antibiótica. S. aureus se cultivó hasta la fase estacionaria en medios ricos químicamente definidos. Los cultivos en fase estacionaria se trataron con 5 μg/mL de delafloxacino en tubos de ensayo durante 24 h, se lavaron con PBS y luego se sembraron en almohadillas de agarosa CA-MHB libres de antibióticos que contenían yoduro de propidio (1,6 μM) para la obtención de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 6: P. aeruginosa durante la recuperación post-antibiótica. Un cultivo en fase estacionaria de P. aeruginosa cultivado en BSM se trató con 1 μg/mL de levofloxacina en tubos de ensayo durante 7 h, se lavó con PBS y luego se sembró en almohadillas de agarosa BSM libres de antibióticos que contenían yoduro de propidio (16 μM) para la obtención de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 7: Ejemplo de adquisición óptima de imágenes. Este vídeo es el canal de fase del vídeo complementario 4 antes del procesamiento de imágenes como ejemplo de una adquisición óptima de time-lapse. Obsérvese la deriva mínima, la iluminación estable y el mantenimiento del enfoque durante todo el experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo complementario 8: Ejemplo de adquisición de imágenes subóptimas debido a la condensación. Este video muestra parte de un experimento en el que la adquisición de imágenes se vio afectada por un enfoque deficiente, probablemente debido a la condensación en la cámara debido a un calentamiento inadecuado de la muestra y/o a la humidificación excesiva del entorno de imágenes. La muestra que se está analizando fue P . aeruginosa tratada con levofloxacino durante la recuperación posterior al antibiótico en una almohadilla de agarosa BSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video complementario 9: Ejemplo de adquisición de imágenes subóptimas debido a la deriva. Este video muestra parte de un experimento en el que la adquisición de imágenes se vio afectada por la deriva de la muestra, probablemente debido a la deshidratación y al encogimiento/levantamiento de la almohadilla de agarosa del cubreobjetos. La muestra fotografiada fue P. aeruginosa en una almohadilla de agarosa que contenía levofloxacino y yoduro de propidio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Archivo complementario 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

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