Name: Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprende a visualizar la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra mediante un protocolo de imagen con pHluorin. Este método permite observar la exocitosis vesicular con sensibilidad mejorada.

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<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Objetivo de inmersión en agua 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>sistema de perfusión por gravedad de 4 canales</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 5x</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de imagen fabricada por Custum</td><td>Physiotech</td><td>custum Una</td><td>placa acrílica negra (10,7 cm de diámetro, 3 mm de grosor) con un pozo (1 cm de diámetro en la parte inferior, 1,5 cm de diámetro en la parte superior) que contiene aproximadamente 0,5 ml de perfusión.</td></tr><tr><td>Dispositivo de E/S digital</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarina dicloruro pentahidratado</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipeta</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>La punta debe recortarse y pulirse al fuego hasta que el diámetro final sea de 1,5 ... 2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminación LED</td><td>X-CYTE</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Mini pinza magnética para tubo de perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Placa de muestra móvil motorizada</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de pipetas</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino (&phi; 0.1mm)</td><td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino (&phi; 0.5 mm)</td><td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Feather #11)</td><td></td></tr><tr><td>Cámara científica cMOS</td><td>Thorlabs CC215MU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal marina</td><td>NAPQO</td><td>Instant Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Isólatero de estímulo</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de succión</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Theta capilar de vidrio</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Si la muestra diseccionada se prepara sin daños tisulares graves y el electrodo de estimulación se inserta correctamente en la médula espinal, se puede obtener una respuesta robusta de pHluorin mediante estimulación eléctrica de alta frecuencia (Figura 4D, E). Es probable que la fluorescencia basal previa al estímulo se debiera a la sonda presente en la superficie de la presinapsis. El aumento de la fluorescencia durante la estimulación refleja la liberación exocitótica de l...

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Estudiamos el mecanismo molecular y celular de la transmisión sináptica utilizando la unión neuromascular de larvas de pez cebra como sistema modelo. Nos interesa clarificar la moderación reguladora de la sinapsis en respuesta a diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo nos permite visualizar una nueva transmisión inducida por el potencial de acción en la unión neuromuscular de las larvas de pez cebra con una sensibilidad mejorada.Podemos monitorizar la función sináptica provocada por una estimulación moderada, que no se ha probado anteriormente. Este protocolo de imagen se puede realizar bajo un microscopio de epifluorescencia convencional y no requiere necesariamente un microscopio de barrido láser confocal. En otras palabras, este método proporciona una plataforma rentable para obtener imágenes de la función neuromuscular en comparación con otras configuraciones experimentales.Para preparar 200 mililitros de la solución extracelular, mezcle 6,4 mililitros de cloruro de sodio 3,5 molar, 0,4 mililitros de cloruro de potasio molar, 1 mililitro de HEPES molar, 0,4 mililitros de cloruro de calcio molar, 0,2 mililitros de cloruro de magnesio molar y 360 miligramos de glucosa. Luego agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 200 mililitros. Agregue 20 microlitros de solución madre de D-tubocurarina de 15 milimolares para preparar 100 mililitros de solución extracelular con 3 micromolares de D-tubocurarina.Para preparar 25 mililitros de la solución extracelular que contiene 0,02 % de tricaína, agregue 0,5 mililitros de solución madre de tricaína al 1 % a 25 mililitros de solución. Con un extractor de micropipetas, tire de los capilares de vidrio theta hasta que el diámetro de la punta mida dentro del rango de 3 a 10 micrómetros. Llene la pipeta con la solución extracelular.Inserte un alambre fino de platino en cada abertura del capilar y sostenga el electrodo de pipeta de vidrio theta en el soporte de pipeta del micromanipulador motorizado. A continuación, conecte el extremo trasero de cada cable al aislador de estímulos. Para 25 mililitros de solución extracelular que contiene 0,02% de tricaína en una placa de Petri de vidrio, transfiera una larva de pez cebra a la placa de Petri para su disección.Usa dos pinzas finas para pelar la piel de las larvas. Use las primeras pinzas para mantener las larvas en su lugar y pellizque la piel del lado dorsal de la vejiga natatoria con las otras pinzas. Luego, con un bisturí, extraiga la vejiga natatoria, los órganos internos y la cabeza.Utilice una pipeta pasteur de vidrio con una punta pulida al fuego para transferir la muestra de pez cebra disecada a la cámara de imágenes. Fije mecánicamente la muestra con un hilo de nylon pegado a un alambre de platino en forma de C para orientarla en un ángulo aproximadamente paralelo al electrodo estimulante. Perfundir la muestra utilizando un sistema de flujo por gravedad a una velocidad de 1 mililitro por minuto con una solución extracelular que contenga 3 micromolares de D-tubocurarina.A continuación, inserte el electrodo de estimulación en la médula espinal. Coloque con cuidado la punta del electrodo cerca de las neuronas motoras espinales, identificadas como neuronas positivas para TagRFP ubicadas en el lado ventral de la médula espinal. Haga avanzar el electrodo en un ángulo oblicuo desde el segmento adyacente hasta la posición objetivo.Para comenzar en una computadora, seleccione la región de imagen en función de la imagen en vivo de la fluorescencia de TagRFP. Asegúrese de que la región seleccionada incluya varios botones y excluya los que se encuentran cerca del límite del segmento corporal. Cambie la unidad de filtro de fluorescencia GFP fluorescencia de flúor para la obtención de imágenes.A continuación, ajuste la intensidad de la fuente de luz para obtener una imagen brillante en el modo de lapso de tiempo de 1 hercio sin saturación. Introduzca el tiempo de exposición a 100 en el campo de milisegundos de exposición de la ventana del microgestor. Configure el software de adquisición de imágenes y el dispositivo de entrada y salida digital para sincronizar la adquisición de imágenes con la estimulación eléctrica.A continuación, determine la frecuencia de estimulación, el número de potenciales de acción y el retardo de tiempo entre el inicio de la adquisición de imágenes y la entrega de la estimulación en el script Arduino. En función de esta configuración, calcule el número total de imágenes necesarias para la adquisición e introduzca este valor en el campo de recuento de la ventana de adquisición multidimensional en micromanager. Establezca un intervalo de 1 segundo en el campo de intervalo para imágenes de lapso de tiempo de 1 hercio.Para la estimulación eléctrica, configure el aislador de estímulo para que entregue pulsos de voltaje constante de 1 milisegundo de 70 milivoltios. Ejecute el comando del digitalizador para comenzar la adquisición de imágenes. Supervise el proceso para verificar que no haya una deriva inaceptable de la imagen y que el flúor y las respuestas sean observables.Modifique la intensidad de la estimulación, como la frecuencia en el número de pulsos, o ajuste la temperatura según el propósito experimental. Guarde las imágenes de lapso de tiempo como una pila de series temporales de TIFF. Se seleccionaron sinapsis con grandes aumentos de señal para el análisis, aunque todos los botones mostraron cambios detectables en la condición de potencial de acción de 20 hercios y 100 pulgadas. Se observaron respuestas robustas de flúor tras la estimulación eléctrica de alta frecuencia con cambios de fluorescencia que indican exocitosis durante la estimulación y posterior descomposición, lo que refleja endocitosis y reacidificación de las vesículas sinápticas.Las constantes de tiempo de decaimiento de la fluorescencia variaron con el estímulo, la intensidad y la temperatura, con 20 hercios, 25 potenciales de acción a 16,6 segundos, 20 hercios, 100 potenciales de acción a 56,8 segundos y 50 hercios 500 potenciales de acción a 62,7 segundos.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Las larvas de pez cebra representan el sistema de vertebrados primer modelo que permite la grabación simultánea de patch clamp de una neurona motora espinal y el objetivo del músculo esquelético. Este video muestra los métodos microscópicos para identificar un CaP segmentaria neurona motora y las células diana muscular, así como las metodologías para la grabación de cada tipo de célula.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico...

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Este video muestra un protocolo para estudiar el reciclaje de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila que expresan canalrodopsina utilizando un colorante fluorescente. La luz azul activa las canalrodopsinas, causando la entrada de calcio y la exocitosis de las vesículas sinápticas. El tinte se integra en las membranas neuronales y se internaliza durante la endocitosis, lo que da lugar a una mayor fluorescencia. Una mayor estimulación de la luz azul induce...

Análisis del reciclaje de vesículas sinápticas y la absorción de colorantes fluorescentes en larvas de Drosophila

Fuente: Schramm, P. et al. Obtención de imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extracción de cráneo y piel. J. Vis. Exp. (2021)Este video muestra la imagen in vivo de neuronas cerebelosas en larvas de pez cebra transgénicas, que expresan proteínas fluorescentes en neuronas de Purkinje. El proceso consiste en anestesiar las larvas, inmovilizarlas en agarosa y eliminar cuidadosamente la piel pigmentada para mejorar la...

Imágenes in vivo del cerebro de larvas de pez cebra para visualizar neuronas cerebelosas

Fuente: Lukasz, D., et al. Imágenes de calcio in vivo de células ciliadas de la línea lateral en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra imágenes en vivo de la afluencia de calcio en las células ciliadas de la línea lateral de una larva de pez cebra transgénica paralizada utilizando un microscopio confocal. La estimulación mecánica de los mechones de cabello a través de pulsos de fluido induce la entrada de calcio a través de canales de mecanotransducción y canales...

Imágenes de la dinámica del calcio en las células ciliadas de la línea lateral de las larvas de pez cebra

El pez cebra es un modelo de sistema que tiene muchas características valiosas, incluyendo claridad óptica, desarrollo externo rápido y, de especial importancia para el campo de la audición y el equilibrio, situado externamente células de pelo sensoriales. Este artículo describe cómo transgénico pez cebra puede utilizarse para análisis función presináptica y mechanosensation célula de pelo en su totalidad.

En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende a visualizar la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra mediante un protocolo de imagen con pHluorin. Este método permite observar la exocitosis vesicular con sensibilidad mejorada.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

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