Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas
7 de febrero de 2025
La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.
Estudiamos el mecanismo molecular y celular de la transmisión sináptica utilizando la unión neuromascular de larvas de pez cebra como sistema modelo. Nos interesa clarificar la moderación reguladora de la sinapsis en respuesta a diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo nos permite visualizar una nueva transmisión inducida por el potencial de acción en la unión neuromuscular de las larvas de pez cebra con una sensibilidad mejorada.
Podemos monitorizar la función sináptica provocada por una estimulación moderada, que no se ha probado anteriormente. Este protocolo de imagen se puede realizar bajo un microscopio de epifluorescencia convencional y no requiere necesariamente un microscopio de barrido láser confocal. En otras palabras, este método proporciona una plataforma rentable para obtener imágenes de la función neuromuscular en comparación con otras configuraciones experimentales.
Para preparar 200 mililitros de la solución extracelular, mezcle 6,4 mililitros de cloruro de sodio 3,5 molar, 0,4 mililitros de cloruro de potasio molar, 1 mililitro de HEPES molar, 0,4 mililitros de cloruro de calcio molar, 0,2 mililitros de cloruro de magnesio molar y 360 miligramos de glucosa. Luego agregue agua ultrapura para llevar el volumen total a 200 mililitros. Agregue 20 microlitros de solución madre de D-tubocurarina de 15 milimolares para preparar 100 mililitros de solución extracelular con 3 micromolares de D-tubocurarina.
Para preparar 25 mililitros de la solución extracelular que contiene 0,02 % de tricaína, agregue 0,5 mililitros de solución madre de tricaína al 1 % a 25 mililitros de solución. Con un extractor de micropipetas, tire de los capilares de vidrio theta hasta que el diámetro de la punta mida dentro del rango de 3 a 10 micrómetros. Llene la pipeta con la solución extracelular.
Inserte un alambre fino de platino en cada abertura del capilar y sostenga el electrodo de pipeta de vidrio theta en el soporte de pipeta del micromanipulador motorizado. A continuación, conecte el extremo trasero de cada cable al aislador de estímulos. Para 25 mililitros de solución extracelular que contiene 0,02% de tricaína en una placa de Petri de vidrio, transfiera una larva de pez cebra a la placa de Petri para su disección.
Usa dos pinzas finas para pelar la piel de las larvas. Use las primeras pinzas para mantener las larvas en su lugar y pellizque la piel del lado dorsal de la vejiga natatoria con las otras pinzas. Luego, con un bisturí, extraiga la vejiga natatoria, los órganos internos y la cabeza.
Utilice una pipeta pasteur de vidrio con una punta pulida al fuego para transferir la muestra de pez cebra disecada a la cámara de imágenes. Fije mecánicamente la muestra con un hilo de nylon pegado a un alambre de platino en forma de C para orientarla en un ángulo aproximadamente paralelo al electrodo estimulante. Perfundir la muestra utilizando un sistema de flujo por gravedad a una velocidad de 1 mililitro por minuto con una solución extracelular que contenga 3 micromolares de D-tubocurarina.
A continuación, inserte el electrodo de estimulación en la médula espinal. Coloque con cuidado la punta del electrodo cerca de las neuronas motoras espinales, identificadas como neuronas positivas para TagRFP ubicadas en el lado ventral de la médula espinal. Haga avanzar el electrodo en un ángulo oblicuo desde el segmento adyacente hasta la posición objetivo.
Para comenzar en una computadora, seleccione la región de imagen en función de la imagen en vivo de la fluorescencia de TagRFP. Asegúrese de que la región seleccionada incluya varios botones y excluya los que se encuentran cerca del límite del segmento corporal. Cambie la unidad de filtro de fluorescencia GFP fluorescencia de flúor para la obtención de imágenes.
A continuación, ajuste la intensidad de la fuente de luz para obtener una imagen brillante en el modo de lapso de tiempo de 1 hercio sin saturación. Introduzca el tiempo de exposición a 100 en el campo de milisegundos de exposición de la ventana del microgestor. Configure el software de adquisición de imágenes y el dispositivo de entrada y salida digital para sincronizar la adquisición de imágenes con la estimulación eléctrica.
A continuación, determine la frecuencia de estimulación, el número de potenciales de acción y el retardo de tiempo entre el inicio de la adquisición de imágenes y la entrega de la estimulación en el script Arduino. En función de esta configuración, calcule el número total de imágenes necesarias para la adquisición e introduzca este valor en el campo de recuento de la ventana de adquisición multidimensional en micromanager. Establezca un intervalo de 1 segundo en el campo de intervalo para imágenes de lapso de tiempo de 1 hercio.
Para la estimulación eléctrica, configure el aislador de estímulo para que entregue pulsos de voltaje constante de 1 milisegundo de 70 milivoltios. Ejecute el comando del digitalizador para comenzar la adquisición de imágenes. Supervise el proceso para verificar que no haya una deriva inaceptable de la imagen y que el flúor y las respuestas sean observables.
Modifique la intensidad de la estimulación, como la frecuencia en el número de pulsos, o ajuste la temperatura según el propósito experimental. Guarde las imágenes de lapso de tiempo como una pila de series temporales de TIFF. Se seleccionaron sinapsis con grandes aumentos de señal para el análisis, aunque todos los botones mostraron cambios detectables en la condición de potencial de acción de 20 hercios y 100 pulgadas. Se observaron respuestas robustas de flúor tras la estimulación eléctrica de alta frecuencia con cambios de fluorescencia que indican exocitosis durante la estimulación y posterior descomposición, lo que refleja endocitosis y reacidificación de las vesículas sinápticas.
Las constantes de tiempo de decaimiento de la fluorescencia variaron con el estímulo, la intensidad y la temperatura, con 20 hercios, 25 potenciales de acción a 16,6 segundos, 20 hercios, 100 potenciales de acción a 56,8 segundos y 50 hercios 500 potenciales de acción a 62,7 segundos.
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Descripción general
Este estudio utiliza la unión neuromuscular de larvas de pez cebra como modelo para investigar la transmisión sináptica. La investigación tiene como objetivo esclarecer cómo se regulan las sinapsis bajo diversas condiciones fisiológicas y patológicas mediante un nuevo protocolo de imagen basado en pHluorina. El estudio destaca la rentabilidad de este método, que permite una observación mejorada de las funciones sinápticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología sináptica
- Electrofisiología
- Imagen óptica
Antecedentes
- El modelo de pez cebra se utiliza ampliamente para estudios de la unión neuromuscular.
- Comprender la función sináptica es fundamental para obtener conocimientos sobre la comunicación neural.
- Estas investigaciones pueden revelar los mecanismos implicados en la regulación sináptica.
- Los métodos anteriores carecían de sensibilidad para escenarios de estimulación moderada.
Objetivo del estudio
- Visualizar la transmisión sináptica inducida por potenciales de acción en pez cebra.
- Mejorar la comprensión de las respuestas sinápticas bajo condiciones controladas de estimulación.
- Proporcionar un método de imagen accesible para futuros estudios sinápticos.
Métodos Utilizados
- Se utilizó una sonda basada en pHluorina para la obtención de imágenes en un microscopio epifluorescente invertido.
- La larva de pez cebra sirve como modelo biológico.
- Se proporciona una preparación detallada de la solución extracelular para los experimentos.
- Se describieron los métodos de disección y fijación de la muestra para facilitar la obtención de imágenes.
- Se especificaron los parámetros para la estimulación eléctrica y la adquisición de imágenes.
Resultados principales
- Las respuestas de fluorescencia robustas durante la estimulación eléctrica de alta frecuencia indicaron la exocitosis de vesículas.
- Los tiempos de decaimiento de la fluorescencia variaron, proporcionando información sobre la intensidad de la actividad sináptica.
- Se observaron cambios detectables en respuesta a frecuencias de estimulación variables.
- Los hallazgos permiten una mejor comprensión de los mecanismos reguladores en las sinapsis.
Conclusiones
- El estudio demuestra una plataforma valiosa para observar la dinámica de la unión neuromuscular.
- Proporciona información sobre los mecanismos moleculares que regulan la respuesta sináptica bajo diferentes condiciones.
- Los hallazgos tienen implicaciones para comprender la fisiología sináptica en contextos más amplios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El imagenológico en tiempo real del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular del pez cebra permite la cuantificación directa de la dinámica de la neurotransmisión en un sistema in vivo genéticamente manejable y rentable. Esta plataforma facilita la desaceleración mecanicista y brinda confianza predictiva para la validación temprana de dianas en neurobiología y para cribados funcionales. Su accesibilidad y escalabilidad la posicionan como una capacidad reutilizable para carteras de neurociencia en fase de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la exo/endocitosis de vesículas sinápticas impulsada por potenciales de acción en un modelo vertebrado vivo.
- Posibilita la interrogación funcional de la regulación sináptica en condiciones fisiológicas y patológicas.
- Facilita la desestimación mecanicista mediante la cuantificación de la cinética de reciclaje de vesículas en respuesta a estímulos definidos.
- Ofrece una plataforma para validar perturbaciones genéticas o farmacológicas que afectan la transmisión sináptica.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona lecturas cuantitativas y resueltas temporalmente de fluorescencia adecuadas para la estandarización y reproducibilidad de ensayos.
- Permite paradigmas de estimulación moderada y alta frecuencia para evaluar los efectos de compuestos o genéticos sobre la función sináptica.
- Facilita la preparación de sistemas biológicos validados y relevantes para enfermedades, destinados a flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Posibilita imágenes escalables mediante microscopios epifluorescentes verticales convencionales, reduciendo las barreras de infraestructura.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con modelos de disfunción sináptica relevantes para la enfermedad, para la exploración de biomarcadores traslacionales.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir ensayos funcionales in vivo.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en métricas cuantitativas del rendimiento sináptico.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de imagen se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder y el desarrollo de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica el reciclaje de vesículas sinápticas para aclarar las vías de neurotransmisión y validar hipótesis funcionales.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos reproductibles de fluorescencia para campañas de detección de compuestos o genéticas.
- Análisis: Permite medir la cinética de decaimiento de la fluorescencia y las amplitudes de respuesta para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con resultados funcionales in vivo en un sistema vertebrado.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y escalable para su uso repetido en diversos programas de descubrimiento en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas sinápticas.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagen y posibilita la reproducibilidad con instrumentación accesible.
- Valor estratégico: Apoya decisiones informadas de avance/no avance y la selección eficiente en cartera con asignación racional de capital en los procesos de neurobiología.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas y mecanismos sinápticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, disección y técnicas de imagenología en vivo.
- Necesita acceso a microscopía epifluorescente vertical y una infraestructura de imagenología y estimulación sincronizadas.
- Exige la estandarización conjunta entre equipos de los parámetros de imagenología y los flujos de trabajo de análisis de datos.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización del protocolo para la expresión de sondas y las condiciones de imagenología.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad en comparación con la imagenología confocal y los desafíos técnicos en la administración de las sondas.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacéuticos
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Preparation of Solutions, Electrodes, and Zebrafish Sample
3:24
Zebrafish Placement in the Imaging Chamber and Stimulating Electrode Insertion
4:22
Time-Lapse Imaging of pHluorin Fluorescence in Zebrafish
6:24
Representative Results
