Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico
10 de enero de 2025
El metabolismo de las plaquetas es de interés, particularmente en lo que se refiere al papel de la hiperactividad e hipoactividad plaquetaria en el sangrado y los trastornos trombóticos. El aislamiento de las plaquetas del plasma es necesario para algunos ensayos metabólicos; Aquí se presenta un método para aislar metabolitos intracelulares de plaquetas lavadas.
Estudié el impacto de la exposición aguda a estrógenos en el metabolismo del carbono central de las plaquetas y las plaquetas activadas en reposo y trombina. Estamos tratando de determinar si la exposición aguda al estrógeno en las plaquetas contribuye al aumento del riesgo trombótico impartido por el uso de anticonceptivos orales. La investigación sobre la salud de la mujer está en gran medida infrafinanciada.
Este proyecto fue parte de un llamado más amplio de los NIH para abordar las brechas en el conocimiento sobre la salud de la mujer. A pesar de que los anticonceptivos están disponibles desde hace más de 50 años, todavía no conocemos el mecanismo exacto que resulta en un mayor riesgo trombótico. Variabilidad biológica.
Las técnicas tradicionales de cultivo celular no se aplican a las plaquetas, lo que significa que las plaquetas provienen de donantes con diferentes genotipos. Se necesitan muestras de gran tamaño, lo que enfatiza la necesidad de un procedimiento de aislamiento plaquetario repetible. Los protocolos de lavado de plaquetas existentes están escritos para expertos en el campo de la biología de las plaquetas.
Hay una serie de desafíos únicos asociados con el trabajo con plaquetas que mi protocolo destaca para el investigador novato de plaquetas. Para comenzar, precaliente el baño de agua a 37 grados centígrados y coloque en él el tampón Tyrode modificado que contiene glucosa. Combine la sangre entera recolectada de todos los vacutainers en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros.
Con una punta de pipeta cortada en bisel, tome un volumen de muestra adecuado para realizar un recuento de células. Aspire cuidadosamente con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho para eliminar las burbujas generadas. Luego deje reposar la sangre en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 25 minutos.
Para evitar la activación durante la centrifugación, agregue prostaglandina I2 y apirasa a la sangre total e invierta el tubo una vez para mezclar la muestra. A continuación, centrifugar toda la sangre a 250 g durante 15 minutos sin descanso a 37 grados centígrados. Recoja el PRP, que aparece como la capa amarilla superior sobre el pelaje leucocitario y la capa roja de sangre en un nuevo tubo cónico inclinado de 50 mililitros a lo largo de la pared.
Deje reposar el PRP durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, mezclar el PRP con 500 nanomolares de prostaglandina I2 y 0,02 unidades por mililitro de apirasa. Centrifugar la mezcla a 1.000 g durante 10 minutos a 37 grados centígrados sin aceleración y sin pausa.
Ahora, utilizando una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho, aspire el sobrenadante para el volumen a granel y, a continuación, utilice una pipeta de un mililitro con una punta sin cortar para aspirar el líquido restante cerca del pellet. A continuación, añada prostaglandina I2 y tampón Tyrode que contiene apirasa al pellet, por el lateral del tubo cónico. Con una punta de corte en bisel y una punta de pipeta de un mililitro, vuelva a suspender suavemente el pellet varias veces.
Una vez que se haya resuspendido el pellet, utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferirlo a un nuevo tubo cónico, dejando atrás los glóbulos rojos o las células visiblemente agrupadas. A continuación, tome una muestra para la citometría de flujo utilizando una punta de pipeta de corte biselado. Incubar el resto de las plaquetas durante una hora a 37 grados centígrados para permitir que los inhibidores desaparezcan.
Después de la incubación, mezcle suavemente la muestra con una pipeta de diámetro ancho y alícuota las muestras para la citometría de flujo. La recuperación media de plaquetas de la sangre total fue de alrededor del 52 %, con una contaminación de glóbulos blancos inferior al 0,1 % después del proceso de lavado. La exposición a la P-selectina fue baja durante todo el proceso de lavado, pero aumentó significativamente después del tratamiento con trombina.
Los niveles de fibrinógeno ligado inicialmente se dispararon después del primer giro de 1.000 G, pero cayeron por debajo del 5% después del segundo giro, aumentando nuevamente significativamente después del tratamiento con trombina. Las plaquetas se controlaron con éxito para determinar el tamaño, los singletes y la positividad de CD42a antes de medir los marcadores de activación. El tratamiento con trombina condujo a un aumento significativo en la expresión de P-selectina y fibrinógeno en comparación con el control.
Para empezar, obtenga las plaquetas lavadas de muestras de sangre humana. Después de preenfriar la microcentrífuga a cero grados centígrados, recoja la suspensión de plaquetas en solución salina normal parcialmente congelada en una proporción de 1:6. Centrifugar la mezcla a 16.000 g durante 10 minutos a cero grados centígrados.
Aspire el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga separado. A continuación, agregue 0,5 mililitros de metanol preenfriado: agua a menos 20 grados Celsius al pellet apagado y al vórtice vigorosamente durante un minuto. Congele la muestra en nitrógeno líquido y descongele a cero grados centígrados.
Centrifugar la suspensión nuevamente a 16.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga. Después de secar el sobrenadante durante la noche, vuelva a suspender el extracto seco en 150 microlitros de agua de grado LC/MS y mezcle durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Realice un vórtice breve y transfiera el extracto a un tubo de microcentrífuga de 0,22 micrómetros para eliminar los restos celulares.
Centrifugar la muestra durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, pipetee 50 microlitros adicionales de agua en el filtro y vuelva a centrifugar durante cinco minutos a 16.000 g y cuatro grados centígrados. Finalmente, recoja el filtrado para su análisis.
La producción de lactato fue positiva en todas las muestras de donantes, mientras que la glucosa y el acetato se consumieron de manera constante, y la trombina aumentó estos flujos.
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Resumen
Este estudio investiga el impacto de la exposición aguda al estrógeno en el metabolismo central del carbono en las plaquetas, centrándose en cómo podría contribuir al mayor riesgo trombótico asociado con el uso de anticonceptivos orales. Describe un método para aislar eficazmente los metabolitos intracelulares de plaquetas lavadas, esencial para ensayos metabólicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Metabolismo de las plaquetas
- Riesgos trombóticos asociados con el estrógeno y los anticonceptivos orales
- Investigación sobre la salud de la mujer
Antecedentes
- La hiper- y la hipoactividad plaquetaria se relacionan con trastornos hemorrágicos y trombóticos.
- Área de investigación tradicionalmente subfinanciada en la salud de la mujer.
- Necesidad de protocolos repetibles en el aislamiento de plaquetas debido a la variabilidad biológica entre donantes.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de metabolitos intracelulares a partir de plaquetas lavadas.
- Se utilizaron muestras de sangre humana para realizar ensayos metabólicos.
- Uso de citometría de flujo y otras técnicas experimentales para el análisis.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de plaquetas con una recuperación promedio del 52 % y contaminación mínima.
- El tratamiento con trombina aumentó significativamente la expresión de P-selectina y fibrinógeno en las plaquetas.
- Alteraciones en los niveles de lactato, glucosa y acetato observadas durante los ensayos.
Conclusiones
- El estudio demuestra un protocolo confiable para el aislamiento de plaquetas y el análisis metabólico.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos detrás de los riesgos trombóticos asociados con el estrógeno en la salud de la mujer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los estudios cuantitativos de flujo metabólico en plaquetas humanas requieren protocolos altamente estandarizados de aislamiento para garantizar la reproducibilidad y minimizar la variabilidad biológica. Este método permite un control preciso del recuento de plaquetas y del entorno metabólico, favoreciendo una validación robusta de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Una preparación confiable de plaquetas sustenta la investigación traslacional sobre trastornos metabólicos y trombóticos, impactando directamente las decisiones del portafolio en las líneas de investigación cardiovascular y de salud de la mujer.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías metabólicas de las plaquetas relacionadas con los mecanismos de enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante el aislamiento de plaquetas en reposo y sensibles a estímulos.
- Facilita la confianza predictiva en la evaluación del fenotipo metabólico en muestras de diferentes donantes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona preparaciones de plaquetas con baja activación y reproducibles para ensayos metabólicos posteriores.
- Normaliza la entrada de muestras para el análisis cuantitativo de los flujos metabólicos.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre el metabolismo y la activación plaquetaria.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona los resultados metabólicos con fenotipos de plaquetas relevantes para la enfermedad, facilitando el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, minimizando la variabilidad entre donantes y procedimientos.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de dianas metabólicas en programas de trombosis y trastornos hemorrágicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de aislamiento de plaquetas se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo estudios metabólicos basados en hipótesis y apoyando la identificación de compuestos prometedores en la investigación de enfermedades cardiovasculares y metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre las respuestas metabólicas de las plaquetas a estímulos o compuestos.
- Selección: Proporciona muestras de plaquetas estandarizadas y listas para ensayos, para mediciones metabólicas reproducibles.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos, como la producción de lactato y el consumo de sustratos, para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Relaciona los fenotipos metabólicos in vitro con factores de riesgo clínicos y estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable para diversos estudios metabólicos y de activación en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los estudios metabólicos de plaquetas y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones estandarizadas, escalables y reproducibles de plaquetas para flujos de trabajo de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/no continuar al permitir un fenotipado metabólico robusto y la priorización de objetivos.
- Impacto en el portafolio: Apoya el avance ajustado al riesgo y la comparabilidad entre programas en la investigación metabólica y trombótica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología y manipulación de plaquetas para minimizar artefactos de activación.
- Exige acceso a citometría de flujo, centrifugación y infraestructura analítica de cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS).
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de aislamiento y ensayos para garantizar la reproducibilidad.
- Puede requerirse adaptación para diferentes poblaciones de donantes o modelos de enfermedad.
- La sensibilidad al esfuerzo cortante de las plaquetas y el riesgo de activación imponen limitaciones prácticas en el rendimiento y la manipulación de muestras.
