Name: Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a preparar plaquetas humanas lavadas para estudios de flujo metabólico cuantitativo. Este protocolo permite aislar metabolitos intracelulares con alta recuperación y mínima contaminación, facilitando investigaciones sobre riesgo trombótico y salud femenina.

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El estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes del estudio. Los participantes informaron que no habían consumido alcohol durante las 48 horas anteriores ni medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) durante los diez días anteriores. Este proyecto cuenta con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número R61HL141794.
1. Extracción de sangre
<ol>
	<li>Preparación para la extracción de sangre. Se recomienda que la recolección de sangre sea realizada por un flebotomista capacitado.</li>
	<li>Realizar la venopunción en la parte interna del brazo con una aguja de 19 G.</li>
	<li>Recoja los primeros ~ 2 ml en un vacutainer sin aditivos y deséchelo. Esto es para eliminar las moléculas de señalización química de las células endoteliales dañadas que pueden activar las plaquetas. Después de recolectar los 2 ml iniciales, retire el torniquete para reducir el esfuerzo cortante en las plaquetas.</li>
	<li>Recoja el resto de la sangre en vacutainers de citrato dextrosa antiocoagulante (ACD-A) en una proporción de 14:3 (sangre:ACD-A). Invierta suavemente cada vacutainer después de la extracción de sangre para mezclar la sangre y el anticoagulante.</li>
</ol>
2. Lavado de plaquetas
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67639/67639fig01.jpg"> 
Figura 1: Etapas sucesivas de centrifugación y resuspensión involucradas en el lavado de plaquetas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67639/67639fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
NOTA: Evite la generación de burbujas de aire. Utilice pipetas de transferencia para eliminar las burbujas cuando se formen, especialmente antes de la centrifugación. Cada vez que los conductos de sangre/plaquetas se abren/cierran, se recomienda respirar dentro del tubo antes de cerrar el tapón para aumentar el nivel deCO2 .
<ol>
	<li>Precaliente la centrífuga a 37 °C para reducir los efectos de la temperatura. Entre cada paso de centrifugación del protocolo, mantenga la centrífuga a 37 °C.</li>
	<li>Precalentar el baño maría a 37 °C. Coloque el tampón Tyrode modificado con glucosa en el baño de agua. NOTA: la receta modificada del tampón de Tyrode se puede encontrar en el Archivo Suplementario 1.</li>
	<li>Combine la sangre entera recolectada de todos los vacutainers en tubos cónicos de polipropileno de 50 mL. Con una punta de pipeta de corte biselado cortada en un ángulo de 45°, tome el volumen de muestra adecuado para realizar un recuento de células (consulte Recuento de células).</li>
	<li>Elimine las burbujas generadas por la aspiración cuidadosa con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho.</li>
	<li>Deje reposar la sangre en un baño de agua durante 25 minutos a 37 °C Esto permite que las plaquetas en un estado de activación reversible (al ser extraídas del cuerpo, transferidas de un tubo a otro, etc.) vuelvan a un estado de reposo.</li>
	<li>Para evitar la activación durante la centrifugación, añadir 500 nM de prostaglandinaI2 (PGI2) y 0,02 U/mL de apirasa a la sangre total y mezclar suavemente invirtiendo una vez.  Elimine las burbujas generadas con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho. NOTA: Las instrucciones para la receta adecuada de IGP2 y apirasa se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1.</li>
	<li>Centrifugar la sangre entera para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) (15 minutos a 250 x g para 42 mL de sangre total) sin freno (37 °C).</li>
	<li>Recoja suavemente el PRP (capa amarilla superior por encima de la capa leucocitaria y capa de sangre roja) en un nuevo tubo cónico de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia de diámetro ancho.</li>
	<li>Al transferir, incline un tubo cónico limpio y pase suavemente el PRP por el costado del tubo. Evite las burbujas de aire.</li>
	<li>Deje aproximadamente 3 mm de PRP para evitar alterar el pelaje leucocitario (la capa de glóbulos blancos entre el PRP y la sangre roja). Si se altera, se verá como un remolino repentino de blanco en la pipeta de transferencia.</li>
	<li>Realice el recuento de células (consulte Recuento de plaquetas) para determinar el volumen de resuspensión para el siguiente paso de lavado.</li>
	<li>Dejar reposar durante 10 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Con una punta de pipeta de corte biselado, tome una muestra para la citometría de flujo (consulte Citometría de flujo).</li>
	<li>Añadir 500 nM PGI2 y 0,02 U/mL de apirasa al PRP y mezclar invirtiendo suavemente una vez.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 minutos a 1000 x g a 37 °C (aceleración:0 freno: 0). El pellet no es compacto y un freno repentino puede causar una remezcla.</li>
	<li>Durante la centrifugación, determine el volumen de resuspensión. Suponga una recuperación del 75%. Haga que la densidad celular sea de aproximadamente 3x105 células/μL.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho para el volumen a granel y una pipeta de 1 ml (punta sin cortar) para el resto del líquido cerca del pellet. Evite tocar el pellet en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Añadir 500 nM PGI2 y 0,02 U/mL de apirasa al tampón Tyrode modificado. Agregue lentamente la cantidad calculada de tampón del paso 16 deslizando por el costado del tubo cónico.</li>
	<li>Con una punta de corte biselado y una punta de pipeta de 1 ml, vuelva a suspender suavemente el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.<ol>
		<li>Ajuste el volumen a 300 μL, presione el émbolo por completo mientras está por encima de la línea de líquido, luego coloque la pipeta debajo del líquido y suba a la primera parada. Esto permitirá al científico volver a suspender el pellet sin crear accidentalmente burbujas de aire que puedan activar las plaquetas.</li>
		<li>Ocasionalmente, hay un anillo de glóbulos rojos visibles en la parte inferior de la bolita. Evite volver a suspender esto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una vez que se haya resuspendido el pellet, utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferir el pellet resuspendido a un nuevo tubo cónico, dejando atrás los glóbulos rojos o las células visiblemente agrupadas.</li>
	<li>Repita los pasos 11 a 20. Asegúrese de añadir 500 nM PGI2 y 0,02 U/mL de una alícuota nueva al tampón Tyrode modificado (no reutilice el tampón Tyrode modificado del paso 18, PGI2 es demasiado inestable).</li>
	<li>Tome una muestra para un recuento de células. Ajuste la concentración de plaquetas según sea necesario con el tampón Tyrode modificado.</li>
	<li>Utilice una punta de pipeta de corte biselado para tomar una muestra para la citometría de flujo.</li>
	<li>Deje reposar las plaquetas durante 1 h a 37 °C para dar tiempo a que los inhibidores desaparezcan y permitir que las plaquetas activadas reversiblemente vuelvan a un estado de reposo.</li>
	<li>Mezclar suavemente con una pipeta de diámetro ancho. Toma de muestras para citometría de flujo.</li>
	<li>Las plaquetas lavadas y en reposo ya están listas para ser utilizadas para el análisis metabólico.</li>
</ol>
3. Recuento de plaquetas
<ol>
	<li>Las plaquetas se pueden contar utilizando un contador automático de células sanguíneas (siga las instrucciones del fabricante) o un hemocitómetro33.</li>
</ol>
4. Citometría de flujo
<ol>
	<li>Preparación<ol>
		<li>Los protocolos detallados y las revisiones de las mejores prácticas para la configuración de mezclas de anticuerpos y la preparación del citómetro de flujo para medir la activación plaquetaria se pueden encontrar en otros lugares34,35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Muestreo<ol>
		<li>Al tomar una muestra para citometría de flujo, recoja la suspensión de plaquetas con una punta de pipeta de corte biselado. Agregue lentamente esto al tubo de microcentrífuga con anticuerpos, luego agite suavemente para mezclar. Dejar incubar durante 30 s.</li>
		<li>Usando la punta de la pipeta de corte en bisel, transfiera la mezcla de suspensión de plaquetas/anticuerpos al pocillo apropiado en la placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Agregue inmediatamente el fijador al pozo para fijar las células.</li>
		<li>Funcionamiento con citómetro de flujo dentro de las 8 h posteriores a la fijación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pruebas de sensibilidad a los agonistas<ol>
		<li>Después del lavado, reserve 2 tubos cónicos de 15 mL, uno para un control de reposo y otro para un control activado por trombina.</li>
		<li>Pipetear suavemente 100 μl de suspensión de plaquetas en cada tubo cónico con una punta de pipeta de corte biselado. Dejar reposar a 37 °C durante 1 h.</li>
		<li>Después de la hora de reposo, agregue 0,1 U/mL de trombina a un tubo (las instrucciones para la preparación de la trombina se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1) y el vehículo al otro. Incubar a 37 °C durante 15 min.</li>
		<li>Tome una muestra de citometría de flujo de cada tubo para determinar la sensibilidad de las plaquetas al agonista.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Muestreo para el análisis cuantitativo del flujo metabólico
<ol>
	<li>Apaga NOTA: La extinción del metabolismo es un paso necesario para medir flujos metabólicos precisos. El enfriamiento rápido de las células y el mantenimiento de su temperatura a 4 °C o menos ralentiza el metabolismo lo suficiente como para que se pueda suponer que está esencialmente detenido para que las células muestreadas reflejen con precisión el metabolismo de las células a granel. Hay una variedad de métodos que se pueden usar, pero para equilibrar la necesidad de enfriamiento rápido y minimizar las fugas, use solución salina normal fría (-4 °C)36. Si la sal interfiere con el análisis posterior, se puede utilizar otro fluido (metanol/agua, etanol, etc.)Artículo 37.<ol>
		<li>Prepare y congele alícuotas de solución salina normal. Hacer cada alícuota salina a 6x el volumen de la muestra deseada. NOTA: la receta de solución salina normal se puede encontrar en el Archivo Suplementario 1.</li>
		<li>Preenfriar la microcentrífuga a 0 °C.</li>
		<li>Recoja la suspensión de plaquetas en solución salina normal parcialmente congelada (&lt; -4 °C) en una proporción de 1:6 (p. ej., recoja 150 μL de suspensión de plaquetas en 750 μL de solución salina en tubos de microcentrífuga). NOTA:No deje la solución plaquetaria/salina en hielo durante más de 15 minutos.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g, 0 °C durante 10 min.</li>
		<li>Guarde el sobrenadante para el análisis de metabolitos externos y el pellet para la extracción y medición de metabolitos intracelulares. Almacene ambos a -20 °C hasta que estén listos para el análisis.</li>
		<li>Repita este proceso en el intervalo de tiempo deseado y en el número de puntos de tiempo de muestra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Extracción de metabolitos intracelulares<ol>
		<li>Añada 0,5 mL de agua de metanol 7:3 preenfriada a -20 °C al pellet enfriado. Vórtice vigorosamente durante 1 min.</li>
		<li>Congele en nitrógeno líquido, descongele a 0 °C, luego repita durante 2 ciclos más.</li>
		<li>Centrifugar las suspensiones a 16.000 x g durante 10 minutos a -4 °C.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Utilice el pellet del paso 3 y repita el protocolo de extracción (pasos 1-3) con metanol:agua 50:50. Agregue el segundo extracto recolectado al primero. Secar toda la noche.</li>
		<li>Vuelva a suspender el extracto seco en 150 μL de agua de grado LC-MS (u otro disolvente apropiado para el análisis previsto). Mezclar durante 15 minutos a 4 °C. Realice un vórtice breve y transfiéralo a tubos de microcentrífuga de 0,22 μm para eliminar los restos celulares. Centrifugar durante 5 minutos a 16.000 x g y 4 °C.</li>
		<li>Retirar de la centrífuga, pipetear 50 μL adicionales de agua optima en el filtro y volver a centrifugar (5 min, 16.000 x g y 4 °C) para enjuagar el filtro. Recopilar para su análisis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Aislamiento de plaquetas inactivas para la investigación metabólica

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; Filtro M Tubos Spin-X</td><td>Millapore-Sigma</td><td>CLS8160</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Aguja de 19 G x 3/4"</td><td>McKesson Corporation</td><td>448406</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>21 G Aguja de 1,5 pulgadas con bloqueo Luer</td><td>Amazon</td><td>B0C39PJD23</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos, media área</td><td>Greiner Bio-One</td><td>675101</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>ACD-A vaccutainers&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>364606</td> Adaptador de <td>flebotomía</td></tr><tr><td></td><td>McKesson Corporation</td><td>609</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>Hisopo con alcohol</td><td>VWR</td><td>15648-916</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>Apirasa de patatas</td><td>Sigma</td><td>A6410-100UN</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>CD42a Anticuerpo monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0428-42</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>refrigerada microcentrífuga&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>75002441 Enfriamiento</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>FITC Anticuerpo antifibrinógeno Abcam</td><td></td><td>4217</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>82922828</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Gasa</td><td>VWR</td><td>76049-110</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Alfa-trombina humana</td><td>Prolytix</td><td>HCT-0020</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>VWR</td><td>87003-292</td><td>General</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Pipeta</td></tr> de <tr><td>transferencia de diámetro estrecho</td><td>VWR</td><td>16001-176</td><td>Lavado de plaquetas</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído, 4% en PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>de flujo PECy5 Ratón Anti-Humano CD62P</td><td>BD Pharmingen</td><td>551142</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Cubierta de placa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>de flujo Tubos cónicos de polipropileno de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Polipropileno 50 mL Tubos cónicos VWR</td><td></td><td>352070</td><td>Lavado de plaquetas</td></tr><tr><td>Prostaglandina I2 (sal sódica)</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>SKC Inc. C-Chip Hemocitómetros desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td>Recuento de células</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Pharmingen</td><td>14-823-41</td><td>Preparación</td></tr> <tr><td>de reactivosTorniquete</td><td>VWR</td><td>76235-371</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>Vacutainer portaagujas</td><td>BD</td><td>364815</td><td>Flebotomía</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Lavado de plaquetas</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de paso ancho</td><td>VWR</td><td>76285-362 Lavado de</td><td>plaquetas</td></tr></tbody></table>

preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

Preparation of Washed Human Platelets for Quantitative Metabolic Flux Studies

Los resultados representativos de la Figura 2 representan 6 donantes de sangre diferentes, incluidos 3 hombres y 3 mujeres. El rendimiento de plaquetas en relación con la sangre total se muestra en la Figura 2A. La recuperación final de plaquetas fue de un promedio de 52% ± 3% (desviación estándar, n = 6). El recuento final de plaquetas en comparación con la contaminación de glóbulos blancos se midió utilizando un analizador de hematología automatizado. Los recu...

Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

Platelets are blood cells that play an integral role in hemostasis and the innate immune response. Platelet hyper- and hypoactivity have been implicated ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Este video muestra el análisis turbidimétrico para evaluar la agregación plaquetaria inducida por colágeno en plaquetas humanas lavadas y previamente tratadas. Los pozos de control muestran la agregación inducida por colágeno, mientras que una alta concentración de inhibidores bloquea los canales de Pannexin-1, inhibiendo así la agregación plaquetaria inducida por colágeno, evidente por la turbidez inalterada.

Un análisis turbidimétrico para monitorear la agregación inducida por colágeno de plaquetas humanas pretratadas

Leucocitos de la sangre y las plaquetas pueden ser utilizados como un marcador bioenergético de la salud general de un individuo y así tienen el potencial para controlar procesos patológicos y el impacto de los tratamientos. Aquí se describe un método para aislar y medir la función mitocondrial y la explosión oxidativa en estas células.

Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

Aquí mostramos plaquetas humanas aisladas se pueden utilizar como un accesible ex vivo modelo para estudiar adaptaciones metabólicas en respuesta al complejo I inhibidor de la rotenona. Este enfoque emplea trazado isotópico y la cuantificación relativa mediante espectrometría de cromatografía de masa líquida y se puede aplicar a una variedad de diseños de estudio.

LC-MS El análisis de las plaquetas humanas como una plataforma para el estudio del metabolismo mitocondrial

Se describe un método sencillo para el aislamiento de plaquetas lavadas a partir de sangre humana seguido por mediciones de la agregación plaquetaria inducida por agonistas por turbidimetría. Como un ejemplo aplicamos este método para estudiar la respuesta de agregación de plaquetas humanas a colágeno después de un pre-incubación con el inhibidor de canales Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetría en plaquetas humanas lavadas: El efecto de la Pannexin1-inhibidor de azul brillante FCF sobre la agregación inducida por colágeno

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Aquí, la sangre del ratón se recogió en presencia de un anticoagulante. Las plaquetas fueron purificadas por medio degradado de iohexol utilizando centrifugación de baja velocidad. Las plaquetas se activaron con trombina para investigar si eran viables. La calidad de las plaquetas purificadas fue analizada por citometría de flujo y microscopía.

Purificación de plaquetas de la sangre del ratón

La formación de plaquetas procoagulantes se ha correlacionado con un mayor riesgo de trombosis. Aquí se presenta un protocolo preciso para aislar plaquetas lavadas de la sangre humana, destinado a cuantificar la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas, que son características distintivas de las plaquetas procoagulantes.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Aprende a preparar plaquetas humanas lavadas para estudios de flujo metabólico cuantitativo. Este protocolo permite aislar metabolitos intracelulares con alta recuperación y mínima contaminación, facilitando investigaciones sobre riesgo trombótico y salud femenina.

Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

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