Evaluación de la fagocitosis microglial de restos de mielina in vitro bajo estimulación magnética repetida

[Instructor] El alcance de nuestro estudio se centra en la investigación en neurorrehabilitación y terapia de simulación magnética. Este protocolo puede proporcionar nuevas ideas para la estimulación magnética al explorar cómo afecta una función clara. Nos centraremos en la neurorrehabilitación y la terapia de estimulación magnética en el futuro.

[Instructor] Para comenzar, obtenga una cabeza decapitada de una rata hembra. Diseccionar la cabeza en hielo. Con unas tijeras, divida el cráneo para exponer completamente el cerebro y facilitar su extracción completa. Use tijeras y fórceps para extirpar meticulosa y asépticamente las membranas, el cerebelo y el hipocampo. Limpie el cerebro tres veces con PBS para eliminar cualquier sangre o tejido residual. Transfiera el cerebro limpio a 10 mililitros de solución de sacarosa estéril 0,32 molares. Con unas tijeras microquirúrgicas, corte el tejido cerebral en trozos para obtener una mezcla de tejido cerebral y sacarosa. A continuación, transfiera la mezcla de tejido cerebral y sacarosa a un homogeneizador estéril de 50 mililitros. Agregue 30 mililitros de solución de sacarosa estéril molar 0.32. Use un homogeneizador de vidrio de 50 mililitros para moler el tejido durante dos minutos. Para obtener un tejido cerebral liso homogeneizado. Diluya el homogeneizado de tejido cerebral a 90 mililitros con una solución de sacarosa estéril de 0,32 molares y mezcle bien. Agregue 20 mililitros de solución de sacarosa estéril molar 0.83 en seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estériles de paredes delgadas. Luego, dispense lentamente 15 mililitros de la mezcla cerebral en la parte superior de los tubos. Nivele los volúmenes con una solución de sacarosa estéril 0,32 molares. Para recoger los restos de mielina en bruto, primero preenfríe y ultracentrifuge el rotor a cuatro grados centígrados. Centrifugar la muestra a 75.000 G durante 45 minutos, luego recoger los restos de mielina de la interfaz entre las dos densidades de sacarosa utilizando una pipeta de pasto estéril. Para la primera separación y purificación isotónica, transfiera la solución de restos de mielina recolectada a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Ajuste el volumen a 35 mililitros con PBS estéril preenfriado y transfiéralo a un nuevo tubo homogeneizador. Después de homogeneizar durante tres minutos, distribuya los restos de mielina homogeneizados uniformemente en seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estériles de paredes delgadas de 38,5 mililitros. Aumente el volumen con PBS estéril y luego centrifuge. Para la segunda separación y purificación isotónica, vuelva a suspender el sedimento blanco sólido en 10 mililitros de PBS estéril preenfriado para obtener una suspensión de restos de mielina. Distribuya la suspensión en tubos de ultracentrífuga como antes y centrifugue. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo blanco sólido en seis mililitros de PBS estéril. Divida la suspensión de restos de mielina en seis tubos de centrífuga de 1,5 y vuelva a centrifugar. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de PBS estéril preenfriado después de desechar el sobrenadante. Descongele los restos de mielina necesarios a cuatro grados centígrados, o en agua helada, y centrifugue como antes durante 10 minutos. Vuelva a suspender los restos de mielina en 200 microlitros de solución CFSE de 50 micromolares. Incube la suspensión a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos, luego centrifugue nuevamente. Deseche el sobrenadante, luego lave las muestras tres veces con 500 microlitros de PBS estéril. Vuelva a suspender los restos de mielina en 100 microlitros de PBS estéril preenfriado para obtener una suspensión de restos de mielina marcados con fluorescencia. Guarde la muestra a -80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para la estimulación magnética repetida in vitro, establezca la frecuencia del tratamiento en 20 hercios, la intensidad del tratamiento en el 1% de la intensidad máxima de salida y el tiempo de estimulación en cinco segundos. Incluya un período de descanso de 20 segundos y administre 600 pulsos durante un solo tiempo de tratamiento de 2,5 minutos. Después de predeterminar los parámetros de estimulación magnética, fije la dirección de la bobina perpendicular al suelo y oriéntela hacia arriba. Esterilice la bobina de estimulación magnética con alcohol para evitar la contaminación celular. Después de agregar 50 micromolares de CFSE, coloque 1,000 células BV-2 en placas de 24 pocillos durante la noche, luego aspire el medio viejo con una pipeta e inmediatamente agregue medio fresco sin suero. Cambie el medio a un medio sin suero y trate las células con un microgramo por mililitro de lipopolisacárido durante 12 horas. Después de 12 horas de intervención con lipopolisacáridos, agregue 100 microgramos por mililitro de restos de mielina al medio para el cocultivo en la oscuridad. Someter las células a estimulación magnética repetida, como se demostró anteriormente. Rocíe alcohol sobre la placa para esterilizarla antes de devolverla a la incubadora. Después de un período de cocultivo con fragmentos de mielina, lave suavemente los restos de mielina no absorbidos con PBS. Fije las células con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. A continuación, agregue 150 microlitros de PBS que contengan 10% de albúmina de suero de burro y 0,3% de Triton X-100 a los pocillos e incube. Después de lavar los pocillos con PBS, agregue una solución de anticuerpos primarios en una proporción de 100 a 200 en los pocillos e incube en frío. Luego, incube las células en un anticuerpo secundario en una proporción de 100 a 300 durante dos horas a temperatura ambiente antes de obtener imágenes con un microscopio confocal. Las células de microglía BV-2 exhibieron una reducción significativa en la fagocitosis de restos de mielina después del tratamiento con lipopolisacáridos. que se revirtió con la intervención repetida de estimulación magnética. El análisis cuantitativo confirmó una disminución significativa en el área de restos de mielina dentro de las células BV-2 en el grupo de lipopolisacáridos en comparación con el control, con un aumento notable en el grupo estimulado magnéticamente tratado con lipopolisacáridos. El porcentaje de microglía positiva para IBA-1 colocalizada con restos de mielina fue significativamente menor en el grupo LPS en comparación con el control, mientras que la estimulación magnética aumentó significativamente este porcentaje. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la fagocitosis microglial con el grupo estimulado magnéticamente tratado con lipopolisacáridos para nuestro grupo que mostró una absorción significativamente mayor de restos de mielina.