Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

Mi investigación se centra en el neurodesarrollo de la cóclea. Específicamente, mi objetivo es descubrir los mecanismos subyacentes de la formación de SNAPS dentro de la cóclea e investigar la conexión entre la enfermedad de Alzheimer y la pérdida de audición. Las imágenes en vivo y las herramientas genéticas están mejorando nuestra capacidad para estudiar las estructuras cocleares y los circuitos neuronales con mayor detalle, proporcionando información más profunda sobre la resiliencia y disfunción del sistema auditor. Al publicar este protocolo, queremos ayudar a los investigadores que son nuevos en la ciencia de los auditores, especialmente a aquellos que no han trabajado con cóclea antes. Esta guía explica paso a paso cómo preparar muestras de oído interno de ratones embrionarios, recién nacidos y adultos. Nuestro objetivo es facilitar los experimentos del oído interno y garantizar que los resultados sean confiables y consistentes. La inmunotinción de sección transversal tiene varias ventajas sobre otros métodos, como la inmunotinción de montaje completo. Conserva bien las proteínas y los ácidos nucleicos, y crea secciones delgadas, casi 2D, lo que hace que las mediciones sean más precisas y consistentes. Este método también mantiene intactos y visibles todos los tipos de células cocleares, mejorando el culto a la inmunotinción. A diferencia de las preparaciones de montaje completo, la sección transversal conserva estructuras importantes, como el ligamento espiral, la estría vascular, la membrana de Reissner y la membrana tectorial.

[Instructor] Para comenzar, coloque al ratón joven sacrificado en una plataforma quirúrgica. Con unas tijeras de disección fina, haga con cuidado una incisión en la línea media a lo largo del cuero cabelludo, comenzando desde el cuello y extendiéndose hacia el hocico. A continuación, coloque la hoja inferior de las tijeras en el foramen magnum y la hoja superior en el cráneo. Corta la mitad superior del cráneo hasta la nariz para completar el segundo corte. Retira las tijeras de la cabeza parcialmente incisa. Coloque la hoja inferior de las tijeras en la parte inferior del cráneo y la hoja superior en el foramen magno. Corta la mitad inferior de la cabeza hasta la nariz para completar el tercer corte. Con fórceps finos y tijeras, separe con cuidado cualquier tejido blando que rodee el hueso temporal, incluido el cerebro, los músculos y el tejido conectivo. A continuación, coloque las medias cabezas del ratón en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga PBS. Reemplace el PBS con una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, enjuague el pañuelo tres veces durante cinco a 10 minutos con PBS. Ubique el hueso temporal o la cápsula del oído interno dentro de la mitad de la cabeza del ratón. Con unas pinzas finas, separe con cuidado el tejido blando que rodea la cápsula del oído interno. Una vez aflojado, corte el tejido alrededor de la cápsula del oído interno. Luego, aplique una presión suave en el área que rodea la cápsula del oído interno con fórceps para liberarla por completo. Almacene las muestras del oído interno en PBS a cuatro grados centígrados. Para comenzar, coloque al ratón adulto sacrificado en una plataforma quirúrgica. Con unas tijeras de disección afiladas, haga una incisión en la línea media a lo largo del cuero cabelludo, comenzando desde el cuello y extendiéndose hacia el hocico. Dobla la piel hacia atrás para exponer el cráneo durante el primer corte. Coloque la hoja inferior de las tijeras en el foramen magnum y la hoja superior en el cráneo. Corta la mitad superior del cráneo hasta la nariz para completar el segundo corte. Retira las tijeras de la cabeza parcialmente incisa. Coloque la hoja inferior en la base del cráneo y la hoja superior en el foramen magno. Corta la mitad inferior de la cabeza hasta la nariz a lo largo de la línea media, evitando las orejas internas. Para cada media cabeza, use fórceps y tijeras para separar el tejido blando que rodea el hueso temporal, incluido el cerebro, los músculos y el tejido conectivo. Luego, enrolle el tejido del cráneo con los dedos y use el pulgar para aplicar una presión suave en la parte inferior del hueso temporal. Afloje gradualmente el hueso de las uniones circundantes. Una vez que se retira la cápsula del oído interno, enjuáguela bien con PBS. Coloque un plato Sylgard lleno de paraformaldehído al 4% bajo el microscopio. Coloque una sola cápsula del oído interno en el plato. Examine el oído interno en busca de tejido blando o hueso adherido y retírelo con cuidado. Identifique la ventana ovalada y retire suavemente el estribo con fórceps. A continuación, con unas pinzas finas, abra un pequeño orificio en el vértice de la cóclea. Con una pipeta P20 llena de paraformaldehído al 4%, enjuague la cóclea para asegurarse de que los líquidos, como sangre diluida o endolinfa, salgan por la ventana ovalada. Transfiera la cóclea fija a una placa de 24 pocillos llena de paraformaldehído al 4%. Marque el tiempo e incube durante 30 a 60 minutos con agitación suave usando un balancín o nutator. Después de la incubación, enjuague la muestra tres veces durante cinco a 10 minutos con PBS. Después del enjuague final, coloque la cóclea en EDTA de 1,25 milimolares y déjela reposar durante dos o tres días a cuatro grados centígrados. Después del tratamiento con EDTA, enjuague la cóclea tres veces durante cinco minutos con PBS. Para comenzar, coloque la cápsula diseccionada del oído interno en una solución de sacarosa al 10% e incube a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, reemplace la solución de sacarosa al 10% con sacarosa al 20% e incube durante otras dos horas. A continuación, sustituya la solución de sacarosa al 20% por sacarosa al 30% e incube la muestra durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la mitad de la solución de sacarosa al 30%. Llene el espacio con una temperatura de corte óptima o compuesto OCT y deje que la muestra se balancee durante 30 minutos a dos horas. Transfiera las muestras a criomoldes etiquetados llenos de compuesto OCT. Compruebe la orientación de la cóclea en el criobloque incrustado. Asegure el oído interno; s lado cóncavo frente a los lados estrechos del criomolde para secciones transversales cocleares estándar. Luego, coloque hielo seco en un recipiente pequeño y agregue de cinco a 10 mililitros de dimetilbutano. Coloque los criomoldes que contienen OCT y la muestra sobre el hielo seco burbujeante para congelar rápidamente el bloque. Transfiera los criobloques a la cámara de un criostato preenfriado a menos 20 grados centígrados. Deje que las muestras se equilibren durante 30 a 60 minutos. Con un lápiz o bolígrafo, marque el lado del criobloque correspondiente a la posición coclear para asegurar la orientación adecuada para la sección. A continuación, agregue un pequeño charco de OCT al mandril y coloque el bloque criogénico sobre él, asegurándose de que el lado ancho sin la marca del lápiz quede hacia abajo. Coloque el mandril que contiene la OCT y la muestra en la cámara de criostato refrigerada, permitiendo que la OCT se congele por completo. Después de unos minutos, coloque el portabrocas con la muestra en el soporte del portabrocas con la marca del lápiz apuntando hacia la derecha o hacia la izquierda. En un criostato, recorte el bloque con un ajuste de 40 micrómetros hasta que el tejido se haga evidente. Una vez que el tejido sea evidente, recolecte una sección de 12 micrómetros utilizando portaobjetos diseñados para criosección. Verifique la ubicación de la sección bajo un microscopio. Si se acerca a giros cocleares, continúe recolectando secciones de 12 micrómetros, verificando periódicamente la posición hasta que se hayan seccionado todos los giros cocleares.