Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Estudiamos la reparación pulmonar después de una infección viral. Nuestro objetivo es comprender los mecanismos por los cuales las células inmunitarias median la reparación epitelial y cómo la remodelación después de una lesión viral y la reparación posterior pueden afectar a futuras patologías de la enfermedad. Este protocolo aborda la incompatibilidad de los digestos pulmonares optimizados para células epiteliales y estromales o células inmunitarias.

Nuestra investigación requiere aislar células viables de compartimentos inmunes y no inmunes. Además, propusimos una estrategia de compuerta para subconjuntos epiteliales y macrófagos, que esperamos beneficie al campo. Nuestro laboratorio investiga la diafonía entre las células inmunitarias y epiteliales en el tracto respiratorio en condiciones de estado estacionario y en respuesta a los desafíos ambientales.

Nuestro objetivo final es determinar la mejor manera de modular esta comunicación para mejorar la reparación de los tejidos y prevenir el desarrollo de enfermedades. Para empezar, rocíe el ratón con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas finas y unas pinzas número siete, haga una incisión en el abdomen y corte lateralmente a través del peritoneo.

Haz un pequeño corte en el diafragma para liberar el vacío. Luego, corte el diafragma y la caja torácica inferior de la cavidad corporal para exponer los pulmones y el corazón. Usando una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 27, perfunda los pulmones con cinco mililitros de EDTA de dos milimolares en DPBS.

Corta verticalmente a través del esternón y a lo largo de los lados para abrir la caja torácica y exponer la tráquea. Use unas tijeras finas y unas pinzas del número siete para extraer la mayor cantidad posible de músculo y tejido conectivo sin perforar la tráquea o los pulmones. A continuación, envuelva la tráquea con una sutura 2/0, colocándola como para atarla, pero sin apretar.

Haga una incisión lateral en la tráquea e inserte el catéter. Luego, apriete la sutura para asegurar el catéter en su lugar. Infle los pulmones con un mililitro de DPBS usando una jeringa.

Luego, tire lentamente de la jeringa para sacar el DPBS. Vuelva a inflar los pulmones con el mismo DPBS y, de nuevo, tire de la jeringa hacia atrás para recoger el líquido de lavado broncoalveolar, o BAL. Desconecte la jeringa del catéter mientras deja el catéter insertado.

Dispense la válvula recolectada en un tubo de microcentrífuga. A continuación, llene la misma jeringa de un mililitro con un mililitro de dispasa. Conecte la jeringa al catéter e infle los pulmones con dispasa.

Mientras retira el catéter, apriete la sutura alrededor de la tráquea para evitar la fuga de dispasa. Con unas tijeras, corte lateralmente a través de la tráquea. Retire los pulmones de la cavidad corporal cortando a través del tejido conectivo a lo largo de la parte posterior de la caja torácica mientras tira de los pulmones y la tráquea hacia arriba.

Luego, extrae el corazón de los pulmones. Coloque los pulmones en cinco mililitros de DPBS en hielo. Válvula centrífuga a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Con una pipeta, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 microlitros de RPMI. Para empezar, disecciona los cinco lóbulos de los pulmones extraídos del ratón y descarta el tejido conectivo. Picar el tejido pulmonar diseccionado con unas tijeras durante un minuto en un portaobjetos de vidrio.

Con unas tijeras de disección, transfiera el tejido pulmonar picado a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Luego, agregue tres mililitros de mezcla digestiva y pipetee la mezcla digestiva pulmonar hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Por último, agregue el pellet de celda recuperado de BAL resuspendido en RPMI.

Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados en un agitador orbital ajustado a 140 RPM a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Después de la incubación, retire el tubo del agitador y colóquelo sobre hielo. Pipetea la mezcla de digestión pulmonar hacia arriba y hacia abajo cinco o seis veces.

Filtre la mezcla a través de un colador de celdas de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Lave las células restantes a través del filtro y neutralice las enzimas con 10 mililitros de 5%FBS en el medio RPMI. Centrifugar la muestra a 600 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Aspire el sobrenadante con un aspirador de vacío. Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de tampón de lisis ACK e incube durante tres minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos. A continuación, añade nueve mililitros de PBS y pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar la solución.

Nuevamente, centrifugue la muestra y use un aspirador de vacío para eliminar el sobrenadante, luego vuelva a suspender el gránulo de células en un mililitro de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia. Filtre la suspensión a través de una malla de 64 micrómetros en un tubo de microcentrífuga para el análisis de citometría de flujo.