Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Nuestra investigación investigó el linaje de monocitos y macrófagos, enfatizando su notable plasticidad y capacidad para integrar múltiples señales del medio ambiente para dar forma a la respuesta efectora durante la inflamación, la reparación de tejidos y las infecciones. Los macrófagos se encuentran en todo el cuerpo y coordinan el inicio y la resolución de la inmunidad innata y adaptada que afecta a la patología protegida e inmunomediada. La reprogramación de macrófagos es la característica más prometedora en este campo.

La tecnología ómica emergente ha revolucionado nuestra comprensión de la biología de los macrófagos, proporcionando información sobre su diversidad fenotípica, la característica funcional, su potencial de programación y el origen del desarrollo de estas células. El principal obstáculo y escollo en el descubrimiento de la diferenciación y polarización de los macrófagos es la heterogeneidad de las condiciones experimentales y los protocolos en toda la literatura y la falta de consenso en la definición del término macrófago. Demostramos el efecto de reprogramación del fármaco y el mediador lipídico en la polarización de los macrófagos y desarrollamos un modelo in vitro en 3D de la interacción entre macrófagos y células de glioblastoma.

Además, hemos demostrado que las plaquetas autorizan la diferenciación de los macrófagos derivados de monocitos al fenotipo N1. Para empezar, coloque muestras de sangre periférica anticoagulada en una centrífuga. Gírelo a 200 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Observe la separación del plasma rico en plaquetas en la parte superior y la fracción celular, incluidos los glóbulos rojos y blancos, debajo. Diluir la fracción celular obtenida de la primera centrifugación con PBS estéril precalentado a temperatura ambiente. Homogeneizar suavemente la solución antes de proceder a la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque.

Transfiera 15 mililitros de Ficoll-Hypaque a un tubo estéril de 15 mililitros. Agregue con cuidado y lentamente 30 mililitros de sangre diluida sobre el Ficoll, asegurando una mezcla mínima entre las fases. Centrifugar el tubo que contiene el Ficoll y la sangre diluida a 600 g durante 25 minutos a temperatura ambiente.

Con una pipeta Pasteur estéril de tres mililitros, retire parte de la capa superior amarilla. Recoja cuidadosamente la interfaz entre la capa amarilla y la capa Ficoll con una pipeta Pasteur estéril. Transfiera las células mononucleares de sangre periférica recolectadas, o PBMC, a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga al menos tres mililitros de PBS estéril.

Rellene el tubo con PBS estéril para alcanzar un volumen total de 12 a 15 mililitros. A continuación, centrifugar la muestra a 600 g durante 10 minutos. A continuación, baje la suspensión PBMC a 300 G durante cinco minutos a 8 a 10 grados centígrados.

Vuelva a suspender las células en el volumen deseado de PBS frío estéril con 2% de FBS. Mantenga las celdas a 4 grados centígrados hasta el siguiente paso. Transfiera el volumen deseado de suspensión de PBMC a un tubo de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros.

A continuación, añade 10 microlitros de cóctel de selección positiva por cada 100 microlitros de suspensión celular. Mezcle bien la suspensión antes de incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, pipetee 10 microlitros de nanopartículas magnéticas por cada 100 microlitros de suspensión celular.

Pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo más de cinco veces para asegurar una suspensión uniforme de las nanopartículas magnéticas. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue PBS que contenga FBS y EDTA a la suspensión para hacer que el volumen total sea de 2,5 mililitros. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces.

Inserte el tubo en el clasificador de imanes y déjelo reposar sin tocar durante cinco minutos. Invierta el imán junto con el tubo con un movimiento continuo. Mantenga el imán y el tubo invertidos durante dos o tres segundos antes de volver a colocarlos en posición vertical.

Retire el tubo del imán y, a continuación, vuelva a añadir 2,5 mililitros de tampón PBS-FBS-EDTA en el tubo. Pipetea suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para mezclarla. Vuelva a insertar el tubo en el imán y apártelo durante cinco minutos.

En un movimiento continuo, invierta el imán y el tubo nuevamente, descartando la fracción sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las celdas en un volumen adecuado de PBS-FBS sin EDTA. Las células seleccionadas positivamente ya están listas para su uso.

Ahora agregue tampón PBS-FBS a las celdas CD14 ordenadas, lo que hace que el volumen total sea de 12 a 14 mililitros para diluir cualquier EDTA restante. Centrifugar a 600 G durante 10 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender los monocitos CD14 seleccionados positivamente en dos mililitros de tampón PBS-FBS.

Cuente las celdas usando un contador automático de celdas. Mantenga las células en hielo hasta la preparación del cultivo. Para el cultivo, vuelva a suspender el pellet a una concentración de un millón de células por mililitro en medio RPMI 1640 suplementado.

Pipetee 250 microlitros de la suspensión celular preparada en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Agregue 250 microlitros de medio RPMI suplementado con antibióticos que contenga 50 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonias de macrófagos en cada pocillo. Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada para iniciar la diferenciación de macrófagos.

En el cuarto día de diferenciación de macrófagos, reemplace la mitad del medio de cultivo de cada pocillo. Agregue citocinas o reactivos para las condiciones de polarización deseadas y continúe cultivando durante tres días más. Recolectar los monocitos derivados de macrófagos en el séptimo día para la caracterización fenotípica.

Los macrófagos M1 inducidos por lipopolisacáridos interferón gamma-plus mostraron la mayor expresión de CD64, una ausencia de CD206 y bajos niveles de CD163 y MERTK. Los macrófagos M2a inducidos por interleucina 4 se caracterizaron por un aumento de la expresión de CD206 y una reducción de los niveles de CD64, CD163 y MERTK. Los macrófagos M2c inducidos por interleucina 10 o dexametasona mostraron un aumento en la expresión de CD163 y CD14, niveles intermedios de CD64 y un aumento en la expresión de MERTK.