Name: Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a generar monocapas 2D de organoides intestinales porcinos y evaluar su resistencia transepitelial mediante cámaras Ussing. Este modelo in vitro replica la fisiología intestinal nativa para estudiar transporte y respuestas secretoras.

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Para este protocolo, se sacrificaron dos cerdos sanos (cerdo Bentheim Blacked Pied; 1 macho, 1 hembra; 4,5 meses de edad; aproximadamente 65 kg) por tiro de perno cautivo y sangrado. De acuerdo con la Ley de Protección Animal, esto (sacrificio y extracción de tejidos) no se clasifica como un experimento con animales, sino que debe ser anunciado al oficial de bienestar animal (registro no. TiHo-T-2023-15) de la Fundación de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover.
1. Recubrimiento de insertos
NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo con materiales estériles bajo un gabinete de seguridad. Todos los pasos del protocolo se realizan en hielo a menos que se indique lo contrario.
<ol>
	<li>Descongele la membrana basal congelada en hielo durante al menos 1 h a temperatura ambiente o durante la noche sobre el hielo a 4 °C. Mezcle la membrana basal 1:40 (v/v) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) helada en un tubo cónico.</li>
	<li>Retire las placas estériles con insertos del embalaje. Añadir 200 μL de mezcla de membrana basal al compartimento apical de cada inserto.</li>
	<li>Vuelva a colocar la tapa de la placa de pocillos e incube durante al menos 1,5 h a 37 °C, 5% deCO2 en una incubadora.</li>
	<li>Aspire la solución con cuidado antes de sembrar las células. Asegúrese de que la punta no toque la membrana durante la aspiración.</li>
</ol>
2. Generación de monocapas de organoides 2D
NOTA: Los organoides del colon porcino se generan y cultivan como se describe para los organoides yeyunales porcinos25. Después de la generación de organoides 3D, estos deben cultivarse durante al menos 3-4 semanas durante el paso semanal para garantizar un crecimiento constante. El número de células dentro de cada cúpula que contienen organoides 3D, que se disuelven en los pasos siguientes, es suficiente para cubrir un solo filtro transmembrana. Antes de la generación de la monocapa, los organoides 3D se sometieron a un control óptico de calidad para comprobar el crecimiento previo y la posible contaminación (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg"> 
Figura 1: Organoides 3D representativos. Los organoides tridimensionales (A) del yeyuno y (B) del colon se examinan cuidadosamente bajo el microscopio antes de generar monocapas. Se presta especial atención a la evaluación de los patrones de crecimiento previos, la integridad estructural y la presencia de impurezas o contaminación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol>
	<li>Retire el medio organoide (Tabla 1) de los pocillos con organoides de cripta 3D. Agregue 1 mL de PBS helado por pocillo y disuelva suavemente la membrana basal pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una punta p1000.</li>
	<li>Recoja todos los organoides disueltos en un tubo de 15 mL precargado con 10 mL de PBS helado. Centrifugar el tubo a 250 x g, 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tripsina/EDTA tibio (37 °C) al 0,05 % (v/v) (se pueden agrupar 2 tubos en esta etapa). Incubar durante 5 minutos a 37 °C en un baño de agua y poner directamente sobre hielo después para detener la reacción.</li>
	<li>Vuelva a suspender en hielo 20 veces con punta p1000 y otras 15 veces con punta p1000 + punta p200 en la parte superior. Añadir 10 mL de DMEM helado suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal para terneros (FCS).</li>
	<li>Tubo de centrífuga a 1.000 x g, 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio monocapa (Tabla 1).</li>
	<li>Determine el número de células vivas por ml utilizando una cámara de Neubauer de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Retire la solución de recubrimiento en este punto del compartimento apical y reemplácela con 500 μL de medio monocapa tibio (37 °C). Añadir 3 mL de medio monocapa al compartimento basolateral.</li>
	<li>Determine la resistencia de la pieza en bruto (TEER) de cada plaquita de transpocillo vacía, como se describe en detalle en el paso 3. El tiempo en el que no hay medio en la cámara apical debe ser lo más corto posible para evitar que las células se sequen.</li>
	<li>Retirar el medio monocapa apical y añadir para el cultivo yeyunal 2D 2 x 105 células epiteliales y para el cultivo colónico 2D 1,5 x 105 células epiteliales en 500 μL de medio monocapa en la cámara apical de cada transpocillo.</li>
	<li>Cambie el medio y mida el TEER cada 2-3 días. Mida el TEER antes de cambiar el medio. Aspire cuidadosamente el medio del compartimento apical y basal y sustitúyalo por 500 μL o 3 mL de medio fresco y tibio (37 °C).<ol>
		<li>Para organoides de yeyuno: el día 16, después de la siembra, cambiar de medio monocapa a medio de diferenciación (Tabla 1). Para los organoides del colon: cambie el medio el día 7 por el medio de diferenciación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cambie el medio de diferenciación todos los días y realice la medición de TEER durante cada cambio de medio. El día 18 (para los organoides yeyunales) o el día 9 (para los organoides del colon), después de la siembra, proceda con los experimentos funcionales.</li>
</ol>
3. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
NOTA: Todas las mediciones se realizan bajo una cabina de seguridad para evitar la contaminación. Antes de sembrar las celdas, se mide cada pocillo transpocillo recubierto vacío para obtener valores en blanco individuales. El voltímetro-ohmio almacena los valores en un dispositivo USB introducido.
<ol>
	<li>Limpie el electrodo de palillo con etanol al 70% (v/v) y deje que el electrodo se seque por completo. Mientras tanto, retire la placa de la incubadora y colóquela debajo del gabinete.</li>
	<li>Introduzca el brazo corto del electrodo de palillo en el compartimento apical de los insertos y el brazo largo en el compartimento basolateral del inserto. Evite el contacto del brazo corto con la capa de células.</li>
	<li>Mida la resistencia eléctrica transepitelial de cada transpocillo. Permita que el voltímetro-ohmio se equilibre para garantizar una medición estable. Mida los valores de TEER haciendo clic en el botón Almacenar.</li>
	<li>Continúe los pasos 3.2 y 3.3 con los pozos restantes. Después de llegar al último pozo, el voltímetro-ohmio abre una solicitud para almacenar los datos en un dispositivo USB. Haga clic en Guardar.</li>
	<li>Limpie el electrodo después de cada placa y al final de la medición y deje que se seque completamente antes de guardarlo.</li>
	<li>Reste los valores en blanco determinados antes de sembrar las celdas de los valores celulares medidos.</li>
</ol>
4. Estudios electrofisiológicos de transporte mediante la técnica de la cámara de Ussing
NOTA: La determinación de los estudios de transporte electrofisiológico se realiza mediante el uso de una cámara de Ussing que consta de dos compartimentos de cámara, que están divididos por el epitelio. Esta cámara está conectada a una pinza de voltaje mediante electrodos de Ag / AgCl. Esta técnica permite el seguimiento de los procesos activos de transporte electrogénico del epitelio a través de los cambios en la corriente de cortocircuito (Isc) inducida por la pinza amperimétrica, así como la resistencia tisular (Rt) calculada por la ley de Ohm. Isc y Rt se registran cada 6 s durante todo el experimento. Durante el experimento, el tejido investigado se airea con carbógeno y se incuba con soluciones de Krebs-Henseleit modificadas para garantizar condiciones viables. La indometacina (10 μM) se añade a las soluciones tampón para inhibir la síntesis de prostaglandinas26.
<ol>
	<li>Calentar las soluciones tampón de mucosa y serosa a 37 °C y airear con carbógeno. Ensamble las cámaras individuales usando un inserto vacío para cada cámara individual. Asegúrese de que los lados apicales de los transpocillos estén todos orientados en la misma dirección.</li>
	<li>Llene todas las cámaras con 5 mL de solución tampón de mucosa precalentada (Tabla 2). Conecte todos los electrodos de la pinza de voltaje a las cámaras individuales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que no haya burbujas de gas que interfieran con los electrodos para garantizar una medición correcta.</li>
	<li>Calibre el software de la cámara de uso con estas condiciones haciendo clic en el botón Rf/dpI en el software de la pinza de voltaje. La resistencia de todos los insertos vacíos usados debe ser igual (~ 70 ohmios) y la corriente debe estar alrededor de 0 mV (± 5 mV). Si este no es el caso de algunas cámaras, verifique la ubicación adecuada de los electrodos o burbujas en el sistema.</li>
	<li>Retire todos los electrodos y deseche la solución tampón usada. Abra todas las cámaras individuales y retire los insertos vacíos. Asegúrese de que se mantenga el orden de las cámaras individuales.</li>
	<li>Mueva la placa de pocillos con insertos de la incubadora al gabinete de seguridad. Aspirar cuidadosamente el medio basolateral y apical.</li>
	<li>Lave las células añadiendo 500 μL de tampón mucoso tibio (37 °C) a la cámara apical y 3 mL de tampón serosa a la cámara basolateral. Aspire los tampones y repita 2 veces.</li>
	<li>Retire los insertos de la placa. Retire con cuidado los soportes de los insertos. Coloque los insertos en las cámaras de uso y asegúrese de que la orientación de los insertos sea la misma que durante la fase de calibración. Ensamble las cámaras individuales como se muestra en la Figura 2.</li>
	<li>Llene las cámaras que miran hacia el lado basolateral de las células con 5 mL de tampón serosa (Tabla 2) y la cámara que mira hacia la cámara apical con 5 mL de tampón mucoso.</li>
	<li>Conecte los electrodos y los tubos de aireación a cada cámara individual. Inicie la medición en el software Ussing. Permita el equilibrio durante 15 min.</li>
	<li>Cambie las condiciones de circuito abierto a condiciones de cortocircuito. Equilibre durante 5 min a 10 min. Añadir 10 μM de forskolina a la cámara serosa. NOTA: La adición de forskolina puede ser reemplazada por otros agentes/sustancias dependiendo de los segmentos intestinales individuales y las preguntas de investigación.</li>
	<li>Después de 15 minutos, agregue más agentes de la misma manera que la forskolina o detenga la medición. Retire los tubos de aireación y los electrodos de las cámaras individuales. Vierta las soluciones tampón de ambas cámaras en un recipiente.</li>
	<li>Desmonte las cámaras y deseche los insertos o utilícelos para análisis de seguimiento (por ejemplo, inmunohistoquímica o análisis de expresión)</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg"> 
Figura 2: Estructura esquemática de la cámara de Ussing. Se muestran ambas cámaras divididas por la membrana con la monocapa 2D crecida. Ambas cámaras están aireadas con carbógeno; El voltaje y la corriente se controlan mediante dos electrodos por cámara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Análisis de los datos generados por la configuración de la cámara de uso
<ol>
	<li>Importe los datos generados por el software de pinza de voltaje a un editor de hojas de cálculo adecuado.</li>
	<li>Para determinar los valores basales de I, sc y Rt , calcule la media de 10 puntos de datos consecutivos tomados 10 minutos después de inicializar las condiciones de cortocircuito. Cada cámara individual sirve como una réplica técnica, mientras que cada paso de organoides sirve como una réplica biológica.</li>
	<li>Para evaluar los efectos de los agentes aplicados, calcule la media de 10 puntos de datos consecutivos inmediatamente antes de la adición del agente. Compare esta media con el valor máximo (o mínimo) observado después de aplicar el agente. Los datos obtenidos se presentan como media ± desviación estándar (DE).</li>
</ol>

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<li>Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+expression+of+claudin+proteins+correlates+with+tight+junction+barrier+properties+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine.</a> J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).</li>
<li>Pearce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+intestinal+epithelia+as+models+for+absorption+enhancement+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies.</a> Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).</li>
<li>Moeser, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+signaling+pathways+activated+by+weaning+mediate+intestinal+dysfunction+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).</li>
<li>Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dysfunction+induced+by+early+weaning+is+attenuated+by+delayed+weaning+and+mast+cell+blockade+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).</li>
<li>Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin%3A+unique+diterpene+activator+of+adenylate+cyclase+in+membranes+and+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).</li>
<li>Herrmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+diversity+of+electrogenic+glucose+transport+characteristics+in+the+small+intestines+of+weaned+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).</li>
<li>Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+in+health+and+disease--sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption in health and disease--sugars.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).</li>
<li>Crane, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+-dependent+transport+in+the+intestine+and+other+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues.</a> Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).</li>
<li>Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride-sensitive+epithelial+Na%2B+channel+currents+in+surface+cells+of+rat+rectal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>HY-10432</td><td>Almacén a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Alemania</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>12634010</td><td>Tienda a 4 &deg; Suplemento de C</td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>17504044</td><td>Almacenar a -20 °C. Descongelar cuando sea necesario</td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>C3306</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa (wasserfrei)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.08337</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>HY-13027</td><td>Almacene a -20 °C Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>M4125</td><td>Almacene a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>154938</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Juego de electrodos (AgCl/PtIr/Std.)</td><td>Instrumentos científicos, Simmerath, Alemania</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburgo, Alemania</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburgo, Alemania</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3 Voltímetro epitelial manual de ohmios Instrumentos</td> de <td>precisión mundiales, Sarasota, EE. UU</td>. <td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>F7524</td><td>Almacén a -20 &deg;C. Descongelar cuando sea necesario</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>F6886</td><td>Almacenar a -20 &deg;C. Descongelar cuando sea necesario</td></tr><tr><td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Alemania</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin 1</td><td>MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>HY-P1097</td><td>Tienda a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>35050061</td><td>Tienda a 4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>1090571000</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>H0887</td><td>Almacén a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Cabina de seguridad biológica de clase II</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td></td> Incubadora de 51033316 <td></td></tr><tr><td>ICO105</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Alemania</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>I7378</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.04936</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>G7513</td><td>Tienda a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>LWRN Supernadante</td><td>hecho a sí mismo&nbsp;</td><td></td><td>Almacene a -20 ° C. Descongele cuando sea necesario. El suplemento LWRN se produce de acuerdo con Miyoshi et al. (2012)</td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana basal, libre de LDEV, 10 mL</td><td>Corning Incorporated - Ciencias de la Vida</td><td>354234</td><td>Almacene a -20 & C. Descongele cuidadosamente en hielo cuando sea necesario</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Alemania</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.05833</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.06580</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>A7250</td><td>Almacenar a -20 &deg;C. Descongelar cuando sea necesario</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.06404</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.06346</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemania</td><td>1.06329</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Cámara mejorada Neubauer</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&ouml; n, Alemania</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ivertido Olympus IX70</td><td>Olympus Corporation, Hamburgo, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU</td>. <td>15140122</td><td>Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>PolymyxinB</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania</td><td>P4932-1MU</td><td>Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>Soporte de microscopio Primovert con fototubo binocular</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>rm EGF</td><td>Prepotech, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>315-09</td><td>Almacene a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU</td>. <td>HY-10295</td><td>Almacene a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - Ciencias de la Vida</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Uso de instrumentos científicos del sistema de base</td><td>, Simmerath, Alemania#</td><td>1317</td><td></td></tr><tr><td>Uso de instrumentos científicos de cámara de difusión</td><td>, Simmerath, Alemania</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>Pinza amperimétrica/corriente VCC6</td><td>Instrumentos científicos, Simmerath, Alemania</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, Nueva Jersey, USA</td><td>HY-10583</td><td>Almacene a -20 &deg;C. Descongele cuando sea necesario</td></tr></tbody></table>

organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

Este protocolo facilita la generación fiable de monocapas 2D porcinas mediante la disgregación de organoides 3D derivados del yeyuno y el colon de cerdos. Durante un período de cultivo de 16 días para los organoides de yeyuno y de 9 días para los organoides de colon, se forman monocapas intactas. Estas monocapas se pueden utilizar posteriormente para evaluar las propiedades de transporte electrogénico y fisiológico mediante la técnica de la cámara de Ussing.
Después de desintegrar los organoid...

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

The gastrointestinal tract (GIT) serves both in the digestion of food and the uptake of nutrients but also as a protective barrier against pathogens. ...

two-dimensional-porcine-intestinal-organoids-reflecting-physiological

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

Generación de organoides intestinales derivados de hiPSC para aplicaciones de modelización del desarrollo y de enfermedades

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Aquí, describimos un protocolo para cultivar organoides 3D intestinales de cerdo a partir de criptas epiteliales criopreservadas. También describimos un método para establecer monocapas celulares derivadas de organoides 3D, permitiendo el acceso al lado apical de las células epiteliales.

Cultivo de organoides 3D intestinales de lechones a partir de criptas epiteliales criopreservadas y establecimiento de monocapas celulares

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides intestinales de ratas y usarlos en varias aplicaciones posteriores. Las ratas suelen ser un modelo preclínico preferido, y el robusto sistema de organoides intestinales satisface la necesidad de un sistema in vitro para acompañar los estudios in vivo .

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

La integración de organoides intestinales caninos y un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ofrece modelos traslacionales relevantes para las enfermedades intestinales humanas. Los protocolos presentados permiten la morfogénesis en 3D y el modelado dinámico in vitro del intestino, lo que ayuda en el desarrollo de tratamientos efectivos para enfermedades intestinales en perros y humanos con One Health.

Morfogénesis tridimensional en el intestino canino en un chip utilizando organoides intestinales derivados de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

Los enteroides están emergiendo como un modelo novedoso para estudiar la fisiología y la fisiopatología de los tejidos, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, describimos un sistema de cultivo derivado de enteroides 2D de células primarias bovinas que permite el cocultivo con tipos de células de tejido relevantes. Este modelo ofrece una ventaja traslacional para el modelado de la investigación gastrointestinal.

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

Este estudio presenta un protocolo para la generación de monocapas 2D intestinales bovinas a partir de organoides, ofreciendo un mejor acceso para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Incluye métodos para evaluar la integridad y funcionalidad de la membrana, avanzando en modelos in vitro que imitan la fisiología gastrointestinal del ganado. Este enfoque promete importantes beneficios biomédicos y agrícolas, incluidas estrategias de tratamiento mejoradas.

Avances en la tecnología de organoides bovinos mediante interfaces monocapa de intestino delgado y grueso

Este video muestra la técnica para extraer el ADN de las especies de microbios residentes en el intestino de termitas. La preparación de una diapositiva en fresco, que es útil para la visualización de la comunidad microbiana intestinal también se ilustra, y un recorrido por la riqueza de especies entorno intestinal es dado.

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

Aprenda a generar monocapas 2D de organoides intestinales porcinos y evaluar su resistencia transepitelial mediante cámaras Ussing. Este modelo in vitro replica la fisiología intestinal nativa para estudiar transporte y respuestas secretoras.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

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