Name: Un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (CHILD) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende el modelo CHILD de conmoción cerebral pediátrica en ratones juveniles para estudiar neuroinflamación crónica, alteraciones de la sustancia blanca y déficits conductuales tras lesión craneoencefálica cerrada.

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Los experimentos se reprodujeron en 2 sitios, la Universidad de Burdeos (Francia) y la Universidad de California Riverside (CA, EE. UU.).
En Burdeos, todos los experimentos se realizaron con ratones machos y hembras P17 C57Bl6J criados en el animalario de la Universidad. Las reproductoras iniciales se obtuvieron de una fuente comercial y se criaron en condiciones estándar con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas, una temperatura de 21 °C ± 1 °C, y una humedad de 55% ± 10%, y alimento y agua proporcionados ad libitum. Los procedimientos experimentales están de acuerdo con las regulaciones del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Burdeos, las leyes francesas que rigen el uso de animales de laboratorio (autorización #29324-2021012118549817 v3), las directivas del Consejo Europeo (86/609/CEE) y las directrices ARRIVE. Este protocolo, al ser un modelo leve de traumatismo craneoencefálico, no produce dolor ni angustia. Como tal, no requiere ningún tratamiento específico del dolor fuera del tratamiento regular del dolor. El destete de las crías (TBI, Shams) fue efectivo a P25.
En Riverside, se obtuvieron comercialmente ratones hembra C57Bl6J preñados E13, y todos los experimentos se realizaron en las camadas resultantes en cachorros machos y hembras de P17. Los animales se criaron con un ciclo automatizado de luz/oscuridad de 12/12 h y una temperatura de 21 °C. Las madres y los cachorros tenían acceso ad libitum a la comida y al agua. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Riverside, y cumplieron con la Ley de Bienestar Animal y la política del Servicio de Salud Pública. Todos los cachorros (TBI, Sham) en esa instalación fueron destetados en P21.
Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Pasos preliminares
<ol>
	<li>Para evitar la hipotermia, caliente la cámara para la inducción de la anestesia y las jaulas de recuperación con anticipación con almohadillas térmicas.</li>
	<li>Coloque el aparato estereotáxico con el impactador montado en un ángulo de 90°.</li>
	<li>Verifique que todas las piezas estén correctamente apretadas y aseguradas y que el pistón esté firmemente atornillado al impactador.</li>
	<li>Corta una lámina de aluminio que se ajuste al aparato estereotáxico (en este caso, 18 cm x 30 cm). El aluminio utilizado aquí es de calidad de aluminio estándar. Envuelva el marco estereotáxico con el papel de aluminio para formar una almohadilla sobre la que se acostará el animal. Asegure la posición y la tensión del papel de aluminio con cinta de laboratorio normal para soportar el peso del animal.</li>
	<li>Encienda el controlador del impactador y, en función de la gravedad de la lesión, establezca la velocidad del impacto en 2 m.s-1 para el grado 1 (G1) o 3 m.s-1 para el grado 2 (G2) para un impacto más severo (modificar este parámetro afectará la gravedad de la conmoción cerebral).</li>
	<li>Pesa a los animales. En P17, el peso de los animales debe ser superior a 5,9 g para los ratones C57Bl6. Quedan excluidos los animales que estén por debajo de ese peso. NOTA: Para algunos estudios, se utilizaron ratones CD1, y para P17, el umbral se fijó en más de 6,5 g (datos personales).</li>
</ol>
2. Procedimiento de lesión cerebral traumática leve juvenil
<ol>
	<li>Anestesiar al ratón con una exposición de 5 minutos al isoflurano. Ajuste la composición del gas a una mezcla del 2,5% (en este caso, el portador es una mezcla de aire sintético con un 21% de oxígeno) con un caudal de 1,5 L/min. NOTA: A partir de este paso, todas las acciones deben realizarse rápidamente, ya que los animales no impactados se despertarán en 5 minutos.</li>
	<li>Coloque la cabeza del ratón debajo del impactador. El cachorro debe estar extendido a todas las longitudes. La punta tiene 3 mm de diámetro y está cubierta de goma para minimizar el efecto del metal en el cráneo.</li>
	<li>Baje el impactador cambiando la perilla a la posición Extender .</li>
	<li>Baje aproximadamente el impactador y coloque el mouse de modo que el impactador quede justo entre las orejas. Luego, deslice el ratón de modo que la punta del pistón se mueva hacia adelante hasta el equivalente a una punta de pistón y una punta de pistón a la izquierda del animal (consulte la Figura 1). NOTA: Los animales simulados se colocan ligeramente lejos del pistón (no se debe impactar ninguna parte del animal).</li>
	<li>Baje el impactador para que haga contacto con la cabeza del animal (Figura 1E2).</li>
	<li>Coloque el impactador en Retraer (Figura 1E3).</li>
	<li>Para determinar la gravedad de la lesión, mueva el pistón 1 mm hacia abajo para el grado 1 (G1). Para impactos más severos de grado 2 (G2), mueva el pistón 3 mm hacia abajo (Figura 1E4).</li>
	<li>Establezca el tiempo de permanencia en 0,1 s, independientemente de la gravedad (la modificación de este parámetro no afectará a la gravedad de la conmoción cerebral).</li>
	<li>Presione Impact en la perilla derecha (Figura 1E5).</li>
	<li>Coloque rápidamente la perilla izquierda en la posición de apagado para que el sistema no se sobrecaliente. Consulte el diagrama de flujo para obtener más información (Figura 2).</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67667/67667fig01.jpg"> 
Figura 1: Posición de la punta del impactador. (A) La punta del impactador se coloca primero en la línea media entre las orejas. (B) A continuación, la punta se desplaza 3 mm hacia delante (el equivalente al diámetro de una punta). (C) Finalmente, la punta del pistón se mueve 3 mm en el lado izquierdo del mouse. (D,E) Posibles posiciones de la punta del impactador con respecto al cañón magnético. (D) El impactador tiene 3 posiciones en relación con el cuerpo del pistón (neutro, retraído o extendido/impacto) con un alcance de 5 mm entre ellas. (E) Posiciones de la punta del impactador en relación con la superficie del cráneo en las diferentes etapas del procedimiento. (1) Posición del impactador en la posición neutra; (2) el pistón se mueve para tocar suavemente el cráneo del animal (paso 2.5); (3) a continuación, el impactador se ajusta para retraerse (paso 3.6); (4) Todo el cuerpo del impactador se desplaza x mm hacia abajo (paso 2.7). Para el grado G1, una velocidad de impacto (y) de 2 m.s-1 con 1 mm de profundidad (x) para G1 o una velocidad de impacto (y) de 3 m.s-1 con 3 mm (x) de profundidad para G2. (5) Una vez que se presiona el impacto de la palanca, la punta del impactador se mueve x mm por debajo de la superficie del cráneo a una velocidad y durante el tiempo de permanencia al volver a la posición neutral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67667/67667fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67667/67667fig02.jpg"> 
Figura 2: Diagrama de flujo de CHILD. Diagrama de flujo que detalla los pasos para inducir la CHILD en ratones PND17 codificados por colores para denotar las diferentes fases de la inducción de la conmoción cerebral. Las fotografías de la instalación incluyen (A) toda la configuración de inducción del NIÑO (el dispositivo de anestesia no es visible), incluido el controlador de impacto, el dispositivo estereotáctico con el impactador y la punta colocados sobre papel de aluminio tenso, y la caja de recuperación ubicada encima de una almohadilla térmica. (B) Punta de impacto de goma (3 mm) con escala. (C) El dispositivo estereotáctico con papel de estaño estirado a través del marco estereotáctico y el solenoide del impactador con la punta de impacto colocada sobre el lámina. (D) Cámara de recuperación asentada sobre la almohadilla térmica. (E) El controlador de impacto con dos interruptores de control, resaltados como en el diagrama de flujo (cuadro rojo = extender/retraer/apagar; cuadro púrpura = interruptor de impacto). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67667/67667fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Seguimiento postraumático
NOTA: Los siguientes pasos se pueden grabar en video para el análisis fuera de línea, lo que permite al experimentador realizar CHILD en varios animales seguidos. No obstante, se deben realizar evaluaciones periódicas y repetidas del bienestar animal.
<ol>
	<li>Anote la duración de la apnea, si está presente (inmediatamente después del impacto) y si hubo una rotación de la cabeza durante el impacto.</li>
	<li>Coloque el ratón en su flanco derecho en una jaula de recuperación.</li>
	<li>Nótese el tiempo de enderezamiento del ratón (encabritado sobre 4 patas) y el tiempo de reanudación de un comportamiento exploratorio. Por lo general, los ratones simulados se despiertan dentro de los 3-4 minutos y reanudan un comportamiento exploratorio 3-4 minutos más tarde (Figura 3). Los ratones CHILD se despiertan dentro de los 7-12 minutos después del impacto (Figura 3A) y reanudan la exploración dentro de los 12-18 minutos después del impacto (Figura 3B), de acuerdo con el sexo y la gravedad del impacto (Figura 3A, B). NOTA: Si el animal impactado no reanuda su comportamiento exploratorio dentro de los 30 minutos, el animal queda excluido.</li>
	<li>Una vez que estén completamente recuperados, regrese a los animales a su jaula de origen. En este punto, el comportamiento de los ratones simulados y NIÑOS (gravedad G1 o G2) debería ser exactamente similar, y los grupos de animales no deberían distinguirse dentro de la camada. NOTA: Los animales pueden ser mantenidos hasta 18 meses después de la lesión14 en las condiciones indicadas al inicio de los métodos. Las evaluaciones de los resultados conductuales se pueden realizar utilizando una batería de pruebas en asociación con mediciones de resonancia magnética, imágenes con miniscopio, histología e inmunohistoquímica12. La inmunohistoquímica para GFAP y NeuN se puede utilizar en puntos de tiempo tempranos para validar el modelo y la presencia de cambios en el tejido.</li>
</ol>
4. Inmunohistoquímica
NOTA: Un día después de la lesión, los animales de los grupos G2 y simulado (n = 4 ratones para G2 y n = 4 para Sham) fueron anestesiados y perfundidos transcárdicamente con paraformaldehído (PFA) al 4% preparado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,4 a 4 °C. Los cerebros se extrajeron10 del cráneo y se sumergieron en la misma solución de PFA durante la noche, y luego se transfirieron a PBS con azida de sodio (0,1%) antes del corte. A continuación, se prepararon secciones coronales de 50 μm de espesor utilizando un vibrátomo. Para un almacenamiento prolongado, las secciones se colocaron en medio crioprotector (30% de etilenglicol y 20% de glicerol en PBS) a -20 °C hasta su uso. Para caracterizar el impacto de la conmoción cerebral en la gliosis cerebral y la pérdida neuronal, se realizó una inmunohistoquímica dirigida a GFAP y NeuN como se describe a continuación.
<ol>
	<li>Lave las secciones del cerebro 4 veces durante 10 minutos en PBS.</li>
	<li>Transfiera las secciones en solución de bloqueo (1% BSA, 0,3% Triton X-100 en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubar secciones durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en solución bloqueante: anti-GFAP de pollo (1:3000) y anti-NeuN de conejo (1:500).</li>
	<li>Lave las rodajas 4 veces durante 10 min en PBS bajo agitación.</li>
	<li>A continuación, transfiera las secciones a una solución de bloqueo que contenga los anticuerpos fluorescentes secundarios diluidos 1:1000 durante 1 h a RT, Alexa-Fluor-488-nm goatat anti-rabbit y Alexa-Fluor-568-nm goat anti-chicken.</li>
	<li>Lavar luego las secciones 4 veces durante 10 min en PBS bajo agitación.</li>
	<li>Monte las secciones en guías con un medio de montaje y agregue un cubreobjetos. Mantenga las diapositivas a 4 °C hasta la adquisición de la imagen.</li>
	<li>Adquiera inmunofluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia y un software micromanager. Utilice un complemento de unión con una lente de 10x para obtener imágenes en mosaico de los hemisferios ipsilateral y contralateral. NOTA: La tinción de control negativo en la que se omitió el anticuerpo primario o el anticuerpo secundario no mostró ningún marcaje detectable. Para un análisis de imágenes más detallado, se puede utilizar el software Fiji15 para cuantificar los parámetros de inmunotinción en varias regiones de interés16.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo CHILD: recapitulación de la conmoción cerebral juvenil y los resultados a largo plazo en ratones

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<li>Hunniford, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+assessment+of+preclinical+multilaboratory+studies+and+a+comparison+to+single+laboratory+studies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A systematic assessment of preclinical multilaboratory studies and a comparison to single laboratory studies.</a> eLife. 12, e76300(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6J mice&nbsp;</td><td>Laboratorio Charles River Francia CRLF 9 Todos. Moulin Berger, 69130 y Eacute; Cully, Francia</td><td></td><td>Burdeos</td></tr><tr><td>Impactador electromagnético</td><td>Leica Biosystems, Richmond, Illinois, EE. UU.</td><td>Impactador</td><td></td>estereotáxico Impact One</tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Olympus, BX41, Center Valley, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex Francia</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo primario GFAP</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>AB5541</td><td>pollo anti-GFAP</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario GFAP</td><td>Sondas moleculares, Invitrogen</td><td>A11034</td><td>cabra anti-conejo AlexaFluor&nbsp; 488</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio de alta resistencia</td><td>Kirkland</td><td>RK611</td><td>obtenido en Cosco</td></tr><tr><td>Micromanager software&nbsp;</td><td>(NIH, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario NeuN</td><td>AbCam, Discovery Drive, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, CB2 0AX, Reino Unido</td><td>AB128886</td><td>conejo anti-NeuN</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario NeuN</td><td>Sondas moleculares, Invitrogen</td><td>A11041</td><td>cabra anti-pollo AlexaFluor 568</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>1.04003</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico - base</td><td>KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, &Eacute; tats-Unis</td><td>900-C</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico - manipulador de electrodos</td><td>KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, &Eacute; tats-Unis</td><td>960</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico - bastidor en U</td><td>KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, &Eacute; tats-Unis</td><td>900-U</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000-10 Medio de</td><td>montaje</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems, Richmond, IL USA VTS1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratorio Jackson El Laboratorio Jackson 600 Main Street Bar Harbor, ME USA 04609</td><td></td><td>UCR</td></tr></tbody></table>

un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (child) 

A Pediatric Concussion Model in Mice: Closed Head Injury with Long-Term Disorders (CHILD)

El modelo CHILD es un modelo relativamente rápido y reproducible de mTBI en ratones pediátricos, que también permite variaciones en la gravedad y la ubicación. Los ratones CHILD, como se esperaba, exhibieron tiempos de recuperación significativamente más largos de una lesión cerrada en la cabeza (Figura 3). Cuando se agregaron las cohortes (n = 36 mujeres falsas, n = 140 hombres falsos, n = 30 mujeres G1, n = 55 hombres G1, n = 32 mujeres G2, n = 141 hombres G2), se observó un retraso en el ...

Un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (CHILD) 

Concussions and mild traumatic brain injuries (mTBI) during childhood represent a significant health endangerment, with many patients later in life ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Yang, Z., et.al. Un modelo repetitivo de lesión en la cabeza por conmoción cerebral en ratones. J. Vis. Exp. (2016). Este video muestra la inducción de lesiones repetitivas en la cabeza por conmoción cerebral en un ratón utilizando un dispositivo de impacto electromagnético. El procedimiento consiste en colocar la punta de impacto entre las suturas interfrontal y lambdoidea en el cráneo de un ratón anestesiado y utilizar una punta de sonda para establecer con precisión la profundidad...

Modelado de lesiones repetitivas en la cabeza por conmoción cerebral en un modelo de ratón

La conmoción cerebral presenta el tipo más común de lesión cerebral traumática. Por lo tanto, un modelo animal de conmoción cerebral repetitivo, que replica las características importantes de una lesión en los pacientes, puede proporcionar un medio para estudiar la conmoción cerebral de una manera rigurosa, controlada y eficiente.

Un modelo de lesión en la cabeza repetidos de conmoción en ratones

Los atletas absorben varios cientos de lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) / concusiones cada año; Sin embargo, la consecuencia de éstos en el cerebro es mal entendida. Por lo tanto, un modelo animal de mTBI único y repetitivo que repeticiones consistentes clínicamente relevantes síntomas proporciona los medios para avanzar en el estudio de mTBI y concusión.

Un Modelo de Ratón de Único y Repetitivo Lesión Cerebral Traumática Leve

El protocolo describe una lesión cerebral traumática leve en un modelo de ratón. En particular, se explica completamente un protocolo paso a paso para inducir una lesión leve en la cabeza cerrada en la línea media y la caracterización del modelo animal.

Modelo electromagnético controlado de cabeza cerrada de lesión cerebral traumática leve en ratones

Aquí, presentamos un modelo de lesión cerebral traumática leve (mTBI) de cabeza cerrada y su validación que muestra una notable similitud con la mTBI humana en lo que respecta a las manifestaciones conductuales durante las etapas aguda y subaguda.

Modelo de Rata de Lesión Traumática Leve de Cabeza Cerrada y su Validación

Este protocolo presenta un modelo murino modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva (rmTBI) inducida a través de un método de lesión craneal cerrada (CHI). El enfoque presenta una ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos para reducir la inflamación comúnmente causada por la exposición a las meninges, junto con una mejor reproducibilidad y precisión en el modelado de rmTBI en roedores.

Modelo de ratón modificado de lesión cerebral traumática leve repetitiva que incorpora ventana de cráneo adelgazada y percusión de fluidos

Aquí describimos una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativo...

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Aquí se describe un método para infligir cabeza cerrada lesión cerebral traumática (TBI) en Drosophila. Este método proporciona una puerta de entrada para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a patologías TBI utilizando la amplia gama de herramientas experimentales y técnicas disponibles para las moscas.

Un método para infligir Cerrado Jefe lesión cerebral traumática en<em&gt; Drosophila</em

Aprende el modelo CHILD de conmoción cerebral pediátrica en ratones juveniles para estudiar neuroinflamación crónica, alteraciones de la sustancia blanca y déficits conductuales tras lesión craneoencefálica cerrada.

Un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (CHILD) (Video) | JoVE Journal

Un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (CHILD)

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