Metodología mejorada para la administración de líquido al pulmón de ratón: intubación mediante un otoscopio de consumo

[Locutor] Metodología mejorada para la administración de líquidos al pulmón del ratón. Intubación con un otoscopio de consumo. Todos los procedimientos con animales y este contenido fueron revisados por el Departamento de Medicina Comparativa de la Universidad de Tulane y están aprobados en el Protocolo 1810. Busque la aprobación de IACUC y consulte al personal veterinario de su institución antes de continuar. El desarrollo de nuevas terapias pulmonares depende de una administración confiable y repetible al pulmón del ratón, pero tradicionalmente se ha basado en la administración intranasal, la aspiración orofaríngea por lengua completa o el corte quirúrgico. El siguiente método ha reducido la variabilidad en comparación con la lengua llena, lo que permite cohortes de animales más pequeñas. También es mucho menos invasivo que el cutdown. Procedimiento, paso uno, configuración. El kit de intubación para roedores inicialmente usaba barcos con cuñas de seguridad de intubación. Estas son pequeñas mangas cónicas que se ajustan sobre un catéter flexible de calibre 20 y una pulgada. Evitan que el catéter dañe la carina. Limpie una cuña de seguridad con una almohadilla de preparación de isopropanol antes de usarla. Deslice la cuña de seguridad limpia, verde aquí, sobre la cánula flexible de calibre 20. Reúna las otras herramientas necesarias, incluido un otoscopio comercial, un teléfono móvil, un soporte para mouse con cono nasal, pinzas dobladas y finamente dentadas, el tubo endotraqueal y la luz de fibra óptica, si se usa. Limpie todos estos con una almohadilla de preparación de isopropanol antes de usarlos. Tome un tubo flexible de aproximadamente 20 centímetros de longitud. Dóblelo en forma de U y agregue una conexión de bloqueo de señuelo en un extremo. Asegure la forma de U con una corbata de torsión. Agregue de dos a 300 microlitros de agua filtrada estéril o tinta china al tubo. En adelante, este conjunto se denomina tubo de burbujas. Tome un lazo de sutura atando 13 centímetros de sutura de seda de tamaño cero en un círculo. Coloque este lazo en la parte superior del soporte del mouse y asegúrese de que ambos lados de la sutura estén bien asegurados. Coloque el soporte del mouse encima de la base de luz de aumento de metal. Coloque las manos amigas alrededor de donde estará la boca del ratón. Coloque un ratón en la cámara de inducción. Utilice oxígeno de caudal constante a 0,8 litros por minuto e isoflurano al 2%. Anestesiar al ratón lo suficiente como para no despertarlo durante la colocación del cono de la nariz. No suprima significativamente la frecuencia respiratoria del ratón. Las respiraciones regulares ayudan a apreciar las cuerdas vocales. Conecte el otoscopio con el teléfono móvil y asegúrese de que la transmisión de video sea estable. Precaución, para minimizar la exposición al isofluorano del investigador durante este procedimiento, use un respirador químico si realiza múltiples intubaciones o capacitación en este método. Alternativamente, realice el procedimiento en algunas maderas. Paso dos, puesta en escena de los animales. Saca al primer animal de la cámara de inducción tan pronto como se duerma. Descogerlos y colocar sus dientes superiores a lo largo de la sutura. Aplique una ligera tensión al animal para mantener la posición de la sutura mientras vuelve a colocar el ratón en el soporte. Ajuste el ángulo del mástil ligeramente hacia atrás, colocando el cuello en una extensión menor de cinco a 15 grados. Empuje suavemente el cono de la nariz sobre las fosas nasales. No empuje el cono de la nariz hacia abajo con firmeza, ya que puede interferir con la sutura que suspende el ratón. Con unas pinzas grandes y finamente dentadas dobladas, sujete firmemente la lengua lo más cerca posible del labio inferior. Tire firmemente hacia abajo y lejos de los dientes superiores y hacia el lado de los dientes inferiores. La precaución, la tracción prolongada, la tensión excesiva o el aplastamiento de la lengua pueden comprometer la salud de los animales. Esté atento a los signos de traumatismo, incluidos hematomas, sangrado, hinchazón o desecación de la lengua. Si se observa alguno, aborte el procedimiento y alerte al personal veterinario. Si usa manos amigas, apoye las pinzas en esta posición. Alimente la luz de fibra óptica si la usa a través del catéter flexible con la cuña de seguridad de intubación en su lugar. Paso tres, apreciación visual de las cuerdas vocales e intubación. Con el otoscopio en la mano no dominante, presione ligeramente la lengua. Luego, inclina la cámara y su fuente de luz para visualizar las cuerdas vocales cerca de la base de la lengua. Debido a ligeras variaciones en la anatomía y el color del tejido, use el movimiento asociado con la respiración para confirmar la identificación estructural. Al principio, orientarse en la transmisión de video puede resultar difícil. Estas son las cuerdas vocales falsas. Estas son las verdaderas cuerdas vocales. Esto es un reflejo del tejido bucal. Esta es la sonda y la luz de fibra óptica. Esta es la epiglotis. Este es el paladar blando. Esta es la rima glotidis, su objetivo para la intubación. Este es el labio del otoscopio, que deprime la lengua. Esta es la región prohibida. Con la luz de fibra óptica encendida, si la usa, alimente la cánula junto con el otoscopio, haciendo un ligero contacto con la base de la lengua o la parte del labio del otoscopio. Como referencia, ajuste el ángulo de aproximación para que el catéter sea muy poco profundo. Inmediatamente después de insertar el catéter, menos de un milímetro más allá de las cuerdas vocales, levante la punta del catéter para que quede casi paralela a la parte superior de la mesa. Esto evita que la epiglotis fuerce el catéter dorsalmente hacia el esófago. Tenga en cuenta que casi no debe haber resistencia al avanzar el catéter. Si encuentra resistencia, retire inmediatamente el catéter y permita que las respiraciones vuelvan a la normalidad. Si se observa sangrado, consulte al personal veterinario. Paso cuatro, confirmación de la colocación del tubo endotraqueal. Además de la confirmación visual de que el tubo está en la ubicación correcta mediante el otoscopio, la tráquea proporciona menos resistencia durante la colocación que el esófago. La profundidad de inserción óptica es de unos cinco milímetros más allá de las cuerdas vocales. La luz se puede ver a través del cuello como un método secundario para confirmar que la profundidad de inserción es la adecuada. Tenga en cuenta que la cuña de seguridad de intubación debe evitar una profundidad excesiva en la colocación del tubo endotraqueal. La cuña de seguridad evitará traumatismos en la corina, pero no tiene por qué impedir el avance. Luego, mientras sostiene el tubo endotraqueal en su lugar, retire la luz de fibra óptica. Confirme la colocación adecuada del catéter utilizando el método del tubo de burbujas. Asegure el tubo de burbujas en su lugar usando el bloqueo inferior. El volumen corriente debe ser evidente de inmediato. De lo contrario, el tubo endotraqueal está fuera de lugar. Retírelo rápidamente y permita que regrese la frecuencia respiratoria normal del ratón. Paso cinco, administración intratraqueal. Al igual que el método de extracción de lengua para el parto orofaríngeo, el parto a través de la intubación corre el riesgo de ahogar al animal. En ratones adolescentes y adultos, 50 microlitros es un volumen de líquido generalmente seguro para administrar y es suficiente para extenderse por los pulmones. Si usa una pipeta para la administración, pipetee el volumen deseado directamente en el catéter y deje que el ratón inhale la solución. Para garantizar la administración difusa a los pulmones, además del líquido administrado a los pulmones con hasta 500 microlitros de aire. Si se desea, se pueden realizar múltiples depresiones de la pipeta sin riesgo de aspiración negativa del líquido suministrado. Tenga en cuenta que puede ser necesario el uso de más del volumen corriente, aproximadamente 200 microlitros, al enjuagar el inóculo con aire. Sin embargo, el uso de 500 microlitros no corre el riesgo de sufrir traumatismos, ya que es solo la mitad de la capacidad vital. Paso seis, evaluación del parto. Una luz de fibra óptica de mano se puede fabricar con componentes de forma barata y fácil de obtener. Se puede utilizar un conjunto de fibra óptica comercial, como se muestra aquí. Sin embargo, basta con una tapa de tubo cónico de 50 ml con un orificio perforado con una aguja de calibre 20 a través de la cual se alimenta un cable de fibra óptica de plástico de .75 milímetros. En este video se utilizaron dispositivos comerciales y hechos a mano. Resultados representativos, la administración intratraqueal mediante intubación da como resultado una mejora en la administración y una reducción de la variabilidad en comparación con la aspiración orofaríngea mediante extracción de la lengua. Comparación directa de la extracción de la lengua y la intubación guiada. Tres investigadores diferentes con niveles enterrados de experiencia o a los que se les pidió que administraran de forma independiente 50 microlitros de tinta china diluida orofaríngeamente mediante extracción de la lengua a ratones C57 BL / 6J de 10 a 12 semanas de edad de ambos sexos. Dos investigadores también administraron el mismo stock y volumen de tinta al pulmón a través de la intubación como se describe. Los pulmones se extrajeron poco después del parto y se fotografiaron con un aumento de 2x. Las fotografías fueron evaluadas para el área teñida por un investigador ciego independiente utilizando la Imagen J. Descubrió que se manchaba más área pulmonar si se usaba intubación. Además, la variabilidad, expresada como desviación porcentual de la media, se redujo si se utilizó la administración intratraqueal después de la intubación en lugar de la extracción de la lengua. Esta estación utilizada para la intubación guiada se prepara como se muestra. De izquierda a derecha, pipetas para el parto, tubo de burbujas para confirmar la colocación adecuada del tubo endotraqueal, fórceps, espátula, espéculo nasal pediátrico, manos amigas, luz de aumento, soporte para ratones con cono nasal, sonda de fibra óptica y cámara de inducción de anestesia. La intubación produce una mayor administración al pulmón con menos variabilidad en relación con la aspiración OP. Ratones hembra de válvula C de 10 semanas de edad recibieron una dosis de 10 veces 10 a la 11ª VG de luciferasa AIV 6.2 y se evaluaron con imágenes bioluminiscentes in vivo siete días después. 10 minutos antes de la imagen, se les inyectó Luciferina por vía subcutánea. Se muestran imágenes representativas de ratones que reciben luciferasa AV 6.2 por aspiración de OP después de la extracción de la lengua o la instalación intratraqueal por intubación. La aspiración orofaríngea por tirón de la lengua condujo a la distribución de la señal en varias partes de las vías respiratorias superiores, mientras que la intubación condujo a una señal concentrada en el pulmón. Las regiones de interés son la misma área y la radiación promedio dentro de la región se muestra en la imagen. La cuantificación de las señales de luciferasa reveló una mejor eficiencia de administración a los pulmones mediante intubación y enfatizó aún más la variabilidad reducida en la administración mediante este método. Conclusión, como se ve en las figuras anteriores, la inoculación interpulmonar utilizando el método tradicional de extracción de la lengua muestra una distribución irregular e inconsistente del inóculo y una mayor variabilidad en la cantidad que llega a los pulmones. Por el contrario, el método de intubación condujo a una administración más consistente tanto en el pulmón derecho como en el izquierdo y fue menos variable. Los resultados positivos sólidamente demostrados de este método de intubación son, uno, la instalación replicable de hasta 50 microlitros en los pulmones del ratón, dos, la distribución difusa del líquido instilado en todos los pulmones y tres, la reducción de la propagación del inóculo más allá de los pulmones. Este método es rápido, seguro y se puede incorporar a los procedimientos de laboratorio sin equipos costosos ni capacitación que requiere mucho tiempo.