Name: Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende a separar proteínas filtradas de cultivo de Mycobacterium tuberculosis mediante electroforesis isoelectrónica y SDS-PAGE. Este método permite identificar fracciones inmunogénicas para desarrollar diagnósticos y vacunas contra la tuberculosis.

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<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&Auml; Sistema de filtración de flujo tangencial KTA</td><td>CYTIVA</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>Anfólitos (pH 3.0 a 10.0)</td><td>BIO-RAD</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>Anfólitos (pH 4.0 a 6.0)</td><td>BIO-RAD</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteína BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>71285-M</td><td></td></tr><tr><td>CAPS</td><td>MERCK</td><td>C2632</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolizado de caseína</td><td>MERCK</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>MERCK</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>MERCK</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>MERCK</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio férrico</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen inclina</td><td>HIMEDIA</td><td>SL001</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>MERCK</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío de liberación rápida Millipore Stericup</td><td>MERCK</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Ortofosfato de dihidrógeno potásico</td><td>MERCK</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>MERCK</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Célula IEF preparativa (Rotofor)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de sodio</td><td>MERCK</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido sódico</td><td>HIMEDIA</td><td>MB095</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>MERCK</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de elute de gel completo&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (cfps) de mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

La Figura 1 ilustra la complejidad de las proteínas filtradas de cultivo (CFP) preparadas. Inicialmente, 100 μg de CFP se sometieron a un análisis PAGE 2D-SDS para evaluar su complejidad. Este análisis reveló la presencia de casi 100 puntos de proteína distintos en el CFP (Figura 1).
Las 20 fracciones recolectadas de cada corrida fueron analizadas por SDS-PAGE. De estas, en la Figura 2 se muestran tres fr...

Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

separation-fractionation-culture-filtrate-proteins-cfps-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Gupta, S., Marcela Rodríguez, G. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el aislamiento escalonado de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas en condiciones limitantes de hierro que imitan el entorno del huésped. Describe el uso de la ultrafiltración, la centrifugación diferencial y la separación por gradiente de densidad para enriquecer e...

Aislamiento de vesículas extracelulares que contienen sideróforos de Mycobacterium tuberculosis

Este video muestra la separación de ácidos micólicos basada en cromatografía de capa fina. Esta técnica separa los diferentes ácidos micólicos (lípidos de cadena larga presentes en la pared celular de las micobacterias) en función de su polaridad.

Separación de variantes de ácido micólico basada en cromatografía de capa fina: un método para separar los lípidos de la pared celular micobacteriana en función de la polaridad

Este video demuestra el aislamiento y la concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano, que incluyen vesículas extracelulares bacterianas, utilizando ultrafiltración. Las vesículas extracelulares concentradas sirven como marcadores diagnósticos para la detección de enfermedades.

Concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano mediante un dispositivo de ultrafiltración

Este video muestra la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para purificar vesículas extracelulares (EV) bacterianas del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La técnica utiliza una columna porosa empaquetada de resina para obtener fracciones purificadas de EV. Las partículas porosas permiten selectivamente que las proteínas más pequeñas entren en los poros, lo que resulta en una elución más lenta. Al mismo tiempo, los EV están excluidos de entrar en los...

Una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

El objetivo es fraccionar y aislar moléculas pequeñas bioactivas, péptidos de un extracto de planta complejo y proteínas de microbios patógenos mediante el empleo de un método de enfoque isoeléctrico de fase líquida (IEF). Además, se identificaron las moléculas separadas y se confirmó su bioactividad.

Separación de Moléculas Pequeñas Bioactivas, Péptidos de Fuentes Naturales y Proteínas de Microbios por Método de Enfoque Isoeléctrico Preparativo (IEF)

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Aquí, demostramos la preparación del filtrado de cultivo de Mtb (CF), que es el medio de crecimiento bacteriano que consiste en proteínas secretadas por las bacterias. Mtb segrega proteínas para modular la señalización del huésped y la respuesta inmunitaria, que son cruciales para la patogénesis. Los CFs preparados se analizan por espectrometría de masas para identificar todos los factores secretores.

Preparación de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis para comprender la patogénesis de la tuberculosis

Este protocolo separa las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana en fracciones simples (1-5 proteínas) utilizando un enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) basado en el punto isoeléctrico, seguido de una separación por peso molecular. Las fracciones resultantes se pueden utilizar directamente para análisis inmunológicos y proteómicos sin necesidad de una mayor purificación.

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Aprende a separar proteínas filtradas de cultivo de Mycobacterium tuberculosis mediante electroforesis isoelectrónica y SDS-PAGE. Este método permite identificar fracciones inmunogénicas para desarrollar diagnósticos y vacunas contra la tuberculosis.

Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

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